Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

저자는 Xvivo 동봉 된 세포 배양 시스템, 특히 매트 프리먼를 사용하는 학습에서의 도움을 Biospherix에서 직원을 인정하고 싶습니다; 마일즈 &amp; 켈리 건설 회사, 실험실 인프라, 특히 러스 휴즈를 설정에서 자신의 작품에 대한 Inc.의 직원; 실험실 리모델링, 특히 아담 Lukhard와 데빈 Hugie 조정에 업무 시설 및 지원 서비스의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 데이터 관리 인프라 및 원격 액세스, 특히 베트남 트란을 설정하는 그들의 도움에 대한 정보 시스템의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 프로젝트, 특히 박사 마리아 Minon와 브렌트 Dethlefs 자신의 오랜 지원을위한 오렌지 카운티 경영진 팀의 아동 병원. 이 작품은 어린이 오렌지 카운티의 병원 회생 Medicin에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 투자되었다PHS에 부여 TR3-05476을 통해 전자. 모든 저자는이 작품에 동일하게 기여했다.

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	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

그들이 다시 챔버를 현미경하고 챔버를 처리하는 인큐베이터에서 이동할 때 CPF에서 성장 세포는 산소 또는 이산화탄소 농도의 변경을 볼 수 없습니다. 각 실의 조건이 세포 배양기에서 제거되기 전에 세포가 유지되는 특정 인큐베이터에 일치하는 것이 중요합니다. 장치 내의 분위기가 연속적 HEPA 여과하고 산소와 이산화탄소의 농도와 관련하여 정의 할 수 있습니다. 세포 또는 PSC를 NSCs의 5 %는 각각 9 %, 표준 농도에서 성장 될 수있다; 또는 대안 농도는 다른 세포 유형 또는 특정 실험을 위해 선택 될 수있다. 따라서, 상기 장치는 의료용 산소, 이산화탄소 및 질소 (도 4)의 일정한 소스로 공급된다. 이 가스의 세 가지 상수 공급을 위해 가스 관련 매니 폴드 시스템에 의해 제공됩니다. 상기 장치는 또한 교정 가스 혼합물로 이루어진 공급되고산소 10 % (± 0.01 %), 이산화탄소. 상기 매니 폴드 시스템은 셀 생산 설비 밖에 수용하고 가스가 천정 설비에 배관되어있다. 교정 가스 설비 내에 수납된다. 장치는 또한 또한 천장을 통해, 집 진공와 함께 제공됩니다. 송신 장치를 전자 제어 시스템을 사용하여 무선 모든 매니 폴드의 출력 압력을 지속적으로 모니터링한다. 모든 압력 범위를 벗어날 경우, 상기 셀 생산 설비 오퍼레이터는 자동적으로 전화를하고 적절한 조치를 취할 수 있도록 통지한다. 장치의 전력 요건은 천장 내림차순 여섯 120 V 전용 회로에 의해 충족 일정한 공급을 보장하기 위해 병원의 백업 발전기에 접속된다. 장치의 작동은 무정전 전원 공급 장치를 통해 구동되는 PC 기반 컴퓨터 소프트웨어를 통해 제어된다. 이러한 전원과 컴퓨터 준비확인이 계속에도 공용 전력 시스템 장애 발생 시스템 기능. 상기 장치를 제어하는 소프트웨어는 산소 및 이산화탄소 농도의 제어뿐만 아니라, 온도, 습도, 및 챔버 압력을 허용하는 사용자에게 친숙한 그래픽 인터페이스 (도 1)을 갖는다. 모든 이들 파라미터의 값은 연속적으로 모든 장치 파라미터의 주행 기록을 제공하기 위해 기록된다. 이 데이터 무결성을 보호하기 위해 매일 밤마다 원격 서버에 백업됩니다. 컴퓨터 및 소프트웨어 평가 및 / 또는 매개 변수를 변경하려면 관리자 사용자가 원격으로 액세스 할 수 있습니다. 또한, 컴퓨터 소프트웨어는 장치 파라미터 대화식 평가를 허용하고 로컬 사용자와 해결 원격으로 액세스 될 수있다. 부가 경보 전송 장치는 상기 장치에 접속되어 전지의 생산 시설 운영자가 장치의 모든 범위를 벗어난 상태를 통지되도록. 원격 액세스 Capabilities은 로그인하고 범위를 벗어난 조건의 세부 평가 할 수 있습니다. 장치는 모듈 형 시스템으로 모두 매크로와 마이크로 의미로 설계되어 있습니다. 이러한 인큐베이터 및 처리 챔버 등의 개별 세포 배양 모듈은, 서로에 대하여 그들의 크기 및 요구 사항에 관해서뿐만 아니라 레이아웃에 정의 될 수있다. 또한, 각 모듈의 제어 기능의 대부분은 자체 모듈 같은 개별 분위기 가스 컨트롤러, 예를 들어, 용이하게 시스템의 상당한 중단없이 교체 될 수있다. 이러한 미세 시각화 및 세포 배양의 조작 하나로 특수 처리 챔버가 쉽게 시스템에 적합하다. 두 위상차 형광 현미경은 살아있는 세포 염색 할 수 있도록, 시스템 (도 6) 내부에서, 그리고 콜로니 t 내부와 같은 대기 조건에 절개 될 수있다그는 인큐베이터. 처리 챔버의 측벽에 밀봉 고리를 통해 케이블 라우팅 전원 공급 장치 및 시스템은 일반적으로 카트 (도 6)에서, 상기 장치의 외부에 유지되어야하는 등의 장치를 허용한다. 셀 생산 설비의 공정 챔버는 종래의 BSC는 상이한 기류 패턴을 갖는다. 기존의 BSC들에서, 공기 흐름은 중앙 배기구에서 아래로 흐르는 다음 캐비닛의 바닥의 전방 및 후방 부분에 두 개의 서로 다른 흡기구에 의해 흡수되는 두 개의 스트림으로 분할합니다. 대조적으로, CPF 천장의 전방 부에서 단일 배출구를 갖는다. 공기는 하향으로 그리고 그 후 흡기 벤트에 상향 인출되는 챔버의 후방을 향해 유동한다. CPF는 본래 매우 청결하지만,이 독특한 기류 패턴 기술자 약간 오염의 위험을 줄이기 위해 자신의 기술을 조정해야한다는 것을 의미한다. 기존의 BSC, 실험실 작업자들과 마찬가지로오픈 세포 배양 접시와 미디어 병의 상류에 손을 배치 hould 마십시오. 그러나, 상류 측 방향은 CPF에 변경되었는지 셀 생산 설비 실험실 자체가 상당히 표준이며, -20 ° C의 냉동고가 장착되어, -80 ° C의 냉동고, 4 ° C 냉장고, 원심 분리기, 수욕. 실험실은 편리한 핸즈프리 작동을위한 발 컨트롤 싱크대가 있습니다. 기능성 임상 셀 생산 설비가되는이 실험 위해서는 그러나 여러 추가적인 변형이 여전히 이루어져야한다. 우선, 상기 장치 자체는 휘발성 유기 화합물, 미립자 및 오염 제거에 사용되는 이산화 염소의 농도를 모니터링 할 수있는 능력이 업그레이드되어야한다. 둘째하는 FACS 시스템을 포함하는 처리 챔버를 수용하고 버퍼 모듈을 통해 상기 장치의 나머지 부분에 연결될 수있다. 이것은 셀 정렬 및 TR 정화용 허용적절한 환경 조건 하에서 ansplantable 세포 집단. 마지막으로, 장치 전체 부드러운 벽 클린 룸 내에 보관되어야한다. 이 장치 (5)에 대한 표준화기구 (ISO) 클래스 8 환경에 대한 국제기구를 제공합니다. CPF의 높은 불임 및 컴퓨터 제어 특성은 세포 기반 치료 양호한 제조 공정 미래 애플리케이션에 이상적인 시스템을 만든다. 오염의 위험이 크게 완화되어 있지만, 더 중요한 것은, 전지 팽창 조건을 자동으로 기록하고, 컴퓨터 시스템에 의해 보관된다. 가스 농도, 온도, 습도 및 시스템에 액세스하는 모든 이벤트의 편차는 엄격하게 설명되어 있습니다. 제품 품질 문제를 조사하는 경우에 매우 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 여전히 한계가있다. 일체의 시약 및 소모품의 사용은 (예를 들면, 미디어 구성 요소, 피펫, 플레이트) 별도로 문서화해야합니다. 더하다itionally의 CPF의 모니터링 시스템에 의해 문서화 변수는 전혀 관련이있는 발생할 수있다 (인간의 오류의 다양한 형태 포함) 잠재​​적 인 문제의 다수가 있습니다. 따라서, 고도로 훈련 된 인력과 작업에 대한 자세한 설명서 설명서에 대한 필요성이 장소에 남아 있습니다.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo System&lt;/i&gt;</td><td>Biospherix</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo&lt;/i&gt; Software</td><td>Biospherix</td><td>version i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Sodium</td><td>Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s-based Cell dissociation Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Serum Supplement</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumable Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serological pipet</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 flask</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1,000 pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

이 원고 일부 상세 셀 생산 설비 및 폐쇄 시스템 내부의 세포를 배양의 고유 한 특징을 설명한다. 셀 생산 설비의 대부분은 작은 크기를 가지며 쉽게 6 × 7.5 m 2 실 (도 2) 내에 수용 될 수있는 특별 주문품, 묶인 세포 배양 장치를 포함한다. 짧은 시간에 실험실 요원 또는 환경에 노출 장치 내의 세포이다. 이 장치는 여러 모듈로 구성하는 처리 챔버, 층류 후드는 후드와 프로세스 챔버, 두 세포 배양 인큐베이터, 처리 챔버에 인접한 현미경 챔버 사이에서 2 버퍼링 에어 록 챔버 (도 3). 이 시스템은 환경 변수 (도 1)를 제어 및 모니터링 할 수 있도록 소프트웨어에 의해 제어된다. 이 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터가 무정전 전원 공급 장치입니다. 가스 번째에 공급산소, 질소 및 이산화탄소 (도 4)에 대한 매니 폴드의 집합으로 전자 시스템. 액티브 세트 및 예약 설정 - 장치의 가스 탱크 두 세트의 각이 매니 폴드 시스템에 의해 제공됩니다. 활성 세트가 아래로 그릴 때, 매니 폴드는 자동으로 예약 설정 및 직원 위해 교체 탱크로 전환됩니다. 전원 백업 발전기 시스템이다. 능성 및 신경 줄기 세포는 신규 장비에 고유 한 추가 합병증, 이전에 개발 된 프로토콜 (9)를 사용하여이 기능에서 저산소 조건에서 재배 할 수있다. 다 능성 줄기 세포를 분리하고 확장된다 완전히 형질 콜로니를 식별 능성 특이 항체를 사용하여, 센다이 바이러스를 이용하여 유도 될 수있다. (도 5A와 B)이 iPSCs로부터, 신경 줄기 세포와 뉴런 듀얼 SMAD 억제를 유도하여, 그 표현형은 USI를 검증 할 수있다<html> NG NSC 특이 항체 (도 5c 및 D). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> 셀 생산 시설에 대한 그림 1. 그래픽 인터페이스. (A)에 CPF의 그래픽 표현은 기본 화면입니다 (그림 1 층) 그림 3. 버퍼 모듈 1 위에 마우스의 클릭으로 표시되는 CAD 도면과 일치 O 2 값 (도 3, 3) 상기 처리 챔버와 일치하도록 설정되어 그 제어 화면 (B)를 연다. 마찬가지로, 프로세스를 클릭 회의소 또는 인큐베이터 1 값이 적절하게 변경하거나 모니터링 할 수 있습니다 각각의 제어 화면 (각각 C와 D를) 나타납니다.<html> rget = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> 는 셀 생산 설비 2. 그림. (A) 정면 우에서 본 시스템. 오른쪽에있는 현미경 액세서리 및 컴퓨터와 천장의 전력 및 가스 연결 및 카트를합니다. (B) 우측에서 본 상기 버퍼 모듈에 액세스 도어와 층류 후드. 후방에 볼 (C) 두 인큐베이터 (블랙 도어)와 프로세스 챔버. (D) 시스템의 오른쪽 통해보기 현미경을 보여주는 거리에서 볼 버퍼 챔버에 문을 모니터링 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> t &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> 셀 생산 설비도 3. CAD 드로잉. 장치 들어가는 모든 항목은 제 층류 후드에서 건조시켜 알코올과 공기 닦여 (1). 항목은 다음 UCPC 모듈에 전달되기 전에 프런트 버퍼 모듈 (2 층)에서 적절한 분위기로 전환하거나하는 공정 챔버 (3). 세포는 두 인큐베이터 (4, 5)에서 배양한다. 라이브 세포 얼룩, 식민지 따기, 일반 세포의 형태 및 마이그레이션 분석의 평가는 UPC 모듈에서 발생, 또는 현미경 회의소 (6). 마지막으로, 폐기물 후면 버퍼 모듈 (2R)를 통해 시스템을 종료합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> 가스 및 전력 그림 4. 소스. (A)는 실험실의 모든 인큐베이터 공급과 같이 CO 2 매니 폴드는 4 × 4 설정입니다. (B)이 O이 매니 폴드는 2 × 2 셋업 및 용품에만 셀 생산 설비가있다. 시스템의 질소는 또한 자동으로 (왼쪽 아래) cryofreezers을 채 웁니다 (오른쪽) 액체 질소 매니 폴드에 부착 (바로 종료 기호 아래에, C) 기화기에서 발생한다. 매니 폴드 (160)는 L 액체 질소 탱크 두 쌍에 의해 제공되는 2 × 2 설치된다. CO 2, O 2, N 2 차단 장치 (D)를 통해 천장에 공급된다. 주택의 진공는이 위치에 공급된다. 시스템에 전원을 공급하는 전원 케이블의 한 쌍의 바로 공급 가스 차단 장치 뒤에 본.F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> 센다이 바이러스에 저산소증에서 파생 된 그림 5. 다 능성 줄기 세포. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (명칭 스토 버 등. 구에 있음), 위상 대비 10 배. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs는 AF-594 표지 트라-1-60, 1 라이브 스테인드 : 미디어 100 희석. 모든 iPSCs 센다이 바이러스, 5 % O 2의 셀 생산 설비에 형질 도입 하였다. 챔버 슬라이드에 5 % O 2에서 성장 SC68.1 - UH0-2I0 - M0S13 - N2G6 IPSC 파생 NSCs의의 (C) 단계의 대비,. 세포를 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고 항 - 인간 네 스틴 차 항체로 염색 알렉스 488 차 항체 하였다. 모든 규모의 바 (100)에있다1;. m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K 조회수.  Childrens Hospital of Orange County Research Institute. Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

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A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

연구

발생학

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

인간 신경 줄기 세포를 Passaging

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

생물학

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

신경과학

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

자동 배양 시스템을 사용한 유도 만능 줄기세포 분화

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

저자 스포트라이트: 재현성 향상을 위한 iPSC 문화 자동화 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

인간 유도 만능 줄기 세포의 유지 및 분화를 위한 자동 배양 시스템

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위한 배아 마우스 뇌 혼합 세포 배양

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

저자 스포트라이트: 감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 마우스 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교세포 배양 확립  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

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