저자는 싱가포르 교육부 (ARC2 / 15 : M4020238)에서 후원하는 Tier 2 교부금에 대한 재정 지원을 인정하고자합니다. 저자는 Machine Shop의 도움을 주신 Chow Wai Hoong Bobby에게 감사드립니다.

모든 동물 실험은 싱가포르 남양 기술 대학교 (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 된 규정과 지침에 따라 수행되었습니다. 1. AR-OR-PAM 시스템 ( 그림 1 ) <ol><li> 시스템 구성 : AR-PAM <ol><li> 다이오드 조사 방식의 고체 상태 Nd-YAG 레이저 (532 nm)와 559-576 nm의 조도 범위를 갖는 염료 레이저로 구성된 나노초 가변 파장 레이저 시스템을 광 조사 광원으로 사용하십시오. 외부 제어기를 사용하여 레이저 파장을 570 nm로 설정하고 레이저 소프트웨어를 사용하여 레이저의 반복 속도를 1 kHz로 설정하십시오. </li><li> 가변 레이저 필터 (NDF1, OD = 0-4.0)를 통해 레이저 출력의 5 %를 광 다이오드로 전환하려면 레이저 앞에 45 ° 각도로 빔 샘플러를 배치합니다. </li><li> 90 °에서 빔 샘플러를 사용하여 레이저 빔을 방향 전환합니다.직각 프리즘 (RAP1)을 포함한다. </li><li> 다른 중립 밀도 프리즘 (RAP2)을 사용하여 광 중성 밀도 필터 (NDF2, OD = 0-4.0)와 멀티 모드 광섬유 (MMF)를 통과시켜 파이버 커플러 (FC) -a 목표 조합 (개구 수 (NA) : 0.25) 및 XY 변환기. </li><li> XY 변환기를 사용하여 광섬유를 스캔 스테이지에 고정하십시오. 광섬유 출력 끝에서 25mm 떨어진 평행 볼록 렌즈 (L1)를 배치하여 광섬유에서 빔을 조준합니다. </li><li> 130 °의 정점 각도를 가진 원추형 렌즈를 통해 평행 광선을 통과시켜 고리 모양의 광선을 생성합니다. cone 각이 70 ° 및 110 ° 인 수제 광학 콘덴서 (OC)를 사용하고 중앙에 구멍이있는 링 모양의 빔을 피사체에 약하게 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 집에서 만든 콘덴서의 중앙에 음향 렌즈 (AL)가있는 50 MHz 초음파 변환기 (UST)를 놓습니다. </li></ol></li><li> 시스템 구성 : OR-PAM <ol><li> 사용다이오드 펌핑 된 고체 상태의 Nd-YAG 레이저 (532 nm)와 559 - 576 nm의 조도 범위를 갖는 염료 레이저로 구성된 나노초 가변 파장 레이저 시스템. 외부 제어기를 사용하여 레이저 파장을 570 nm로 설정하고 레이저 소프트웨어를 사용하여 5 kHz에서 레이저의 반복 속도를 설정하십시오. </li><li> 컴퓨터 제어 회전 스테이지 (RAP1 유지)를 90 ° 회전하여 레이저 빔을 조리개로 돌려 방향을 바꿉니다. </li><li> 빔을 따라 가변 중성 필터 (OD : 0-4.0)를 배치 한 레이저 빔을 감쇄시킨 다음 콘덴서 렌즈 (CL)로 빔을 집중시킵니다. 공간 필터링을 위해 CL에서 75 mm 떨어진 핀홀 (PH)을 통과시킵니다. </li><li> SMF에 광선을 집중시키기 위해 0.1 NA 대물 렌즈로 구성된 단일 모드 광섬유 커플러 (FC)를 사용하여 SMF (단일 모드 광섬유)로 공간 필터링 된 빔을 시작하십시오. </li><li> 최대 커플 링 효율을 얻기 위해 파이버 커플러를 조정하십시오. </li><li> 섬유를 t 위에 고정 시키십시오.그는 슬립 플레이트 (SP)를 사용하여 스테이지를 스캐닝한다. 레이저 빔을 평행하게 만들기 위해 SM 섬유에서 50mm 떨어진 색소 렌즈 (L2)를 놓습니다. </li><li> 또 다른 동일한 무색 렌즈 (L3)의 후면 구경을 채우기 위해 운동 가능한 제어 타원형 거울 (M)을 사용하여 평행 광선을 90 ° 방향 전환하십시오. 렌즈 튜브 (LT)를 사용하여 초점을 맞추는 데 사용되는 무색 렌즈를 번역 마운트 (TM2)에 놓습니다. </li><li> 사이에 실리콘 오일 (SO) 층이있는 직각 프리즘 (RA)과 편평한 프리즘 (RP)으로 구성된 수제 광 음향 빔 결합기를 통해 집속 빔을 전달하십시오. 참고 : 실리콘 오일 층은 광학적으로 투명하고 음향 적으로 반사되는 막 역할을합니다. </li><li> 마름모꼴 렌즈 (AL)를 부착하여 마름모꼴 프리즘의 바닥에 음향 집속 (초점 직경 : ~ 46 μm)을 제공하십시오. </li><li> 마름모꼴 프리즘 상단에 50 MHz 중심 주파수의 초음파 트랜스 듀서를 놓습니다. 효과적인 커플 링을 위해 에폭시 층을 사용하십시오. </li></ol></li></ol&gt; 2. 시스템 스위칭 및 정렬 <ol><li> 수제 전환 가능한 플레이트를 컴퓨터에 연결된 3 축 컨트롤러로 제어되는 3 축 전동 스테이지에 고정 (단단히 조여서). </li><li> 케이지 마운팅 브래킷을 사용하여 AR 및 OR 케이지 시스템을 홈 메이드 플레이트에 부착하면 AR 및 OR 스캔 헤드를 쉽게 전환 할 수 있습니다. 스캔 헤드를 이미징 영역의 위쪽으로 밉니다. </li><li> AR-OR-PAM 스캐너 헤드의 바닥 부분을 음향 결합을 위해 물이 채워진 아크릴 탱크 (13 cm x 30 cm x 3 cm)에 잠기 게하려면 Z- 스테이지를 사용하십시오. </li><li> 탱크 바닥 판에 직경 7cm의 이미징 창을 열고 광학 및 음향 전달을 위해 폴리에틸렌 막으로 밀봉하십시오. </li><li> 펄스 변환기 및 오실로스코프를 사용하여 초음파 변환기에 초점을 맞 춥니 다. <ol><li> 송신 / 수신 모드에서 펄스 에코 증폭기의 이득을 24dB로 설정하십시오. </li><li> 싱크 아웃 신호 fr 사용펄스 에코 증폭기를 트리거로 사용하고 오실로스코프를 사용하여 유리 슬라이드 (물 탱크의 바닥에서 삽입)에서 후방 산란 신호를 감지합니다. 참고 : 슬라이드에는 검정색 테이프가 붙어 있어야합니다. </li><li> Z 축을 이동하여 펄스 에코 신호의 진폭을 최대화하십시오 (오실로스코프에서 확인). 참고 : 유리판에 초점이 맞춰지면 에코의 진폭은 최대가됩니다. </li></ol></li><li> 레이저를 켜고 UST를 BNC 케이블을 사용하여 각각 24dB 고정 게인의 두 개의 앰프에 연결하십시오. 참고 : 앰프의 출력은 데이터 수집 카드 (DAQ)에 연결됩니다. </li><li> 레이저 앞에있는 포토 다이오드 (PD)의 신호를 데이터 수집 시스템의 트리거로 사용하십시오. </li><li> AR-PAM에서 원추형 렌즈 (con.L)와 광학 응축기 (OC) 사이의 거리를 변경하여 검사 대상에서 생성 된 광 음향 신호의 진폭을 최대화하십시오 (유리 슬라이드에 검은 색 테이프가 붙음).최대 광 음향 (PA) 신호 진폭을 결정하여 광학 및 음향 초점이 공 초점인지 확인하십시오. <ol><li> 최대 PA 신호의 지연을 확인하십시오. 나중에 이것을 사용하여 데이터 수집 소프트웨어의 포커스를 확인하십시오. </li></ol></li><li> 스캐닝 헤드의 나사를 풀고 스캐닝 헤드를 수동으로 AR-PAM에서 OR-PAM으로 전환하십시오. 그런 다음 나사를 조이십시오. </li><li> OR-PAM에서 오실로스코프에 표시된 PA 신호 진폭을 최대화하려면 초점 무색 이중 복사 (렌즈 튜브 (LT) 내부)와 광 음향 합성기 사이의 거리를 변경하십시오. <ol><li> 최대 PA 신호의 지연에 유의하십시오. 참고 : 공 초점 배열을 결정하기 위해서는 파인 튜닝이 필요합니다. </li></ol></li></ol> 3. 실험 단계 <ol><li> 횡 해상도 및 영상 깊이 정량화 <ol><li> 직경 100 nm의 금 나노 입자를 사용하여 AR의 횡 방향 해상도를 결정합니다.d OR 시스템. </li><li> 동량의 물로 0.1 mL의 나노 입자 용액을 희석한다. 희석 된 용액 0.1 mL를 커버 슬립에 분배하고 탱크 아래의 폴리에틸렌 멤브레인과 접촉시킨다. </li><li> 스캐닝 (단계 2.8 및 2.10) 전에 AR-PAM 및 OR-PAM이 데이터 수집 소프트웨어 (재료 표 참조)에 포커스가 있는지 확인하십시오. 참고 : 2.9 및 2.10 단계에서 샘플링 속도 (250 MS / s)를 곱한 최대 PA 신호의 마이크로 초 지연을 알면 이미지가 데이터 수집 소프트웨어에서 초점을 맞 춥니 다. 데이터 수집 중에 생략해야하는 지연은 후 처리를 위해 필요한 데이터 포인트 만 저장하도록 소프트웨어에서 결정될 수 있습니다. </li><li> AR-PAM의 스캔 파라미터를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작합니다. <ol><li> 데이터 수집 소프트웨어의 AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 &quot;속도&quot;에서 &quot;4&quot;mm / s 스캐닝 속도로 설정합니다.; 탭, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭에서 &quot;1&quot;kHz, &quot;Y- 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;0.5&quot;mm, &quot;X- 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;0.5&quot;mm. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향의 스텝 크기를 &quot;4&quot;μm로 설정하십시오. 참고 : y 방향의 스텝 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복률 (이 경우 4,000 μm / 1,000 Hz = 4 μm)에서 자동으로 결정됩니다. </li></ol></li><li> OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작하십시오. <ol><li> &quot;속도&quot;탭의 &quot;2.5&quot;mm / s 스캐닝 속도, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭의 &quot;5&quot;kHz, &quot;Y- 스캔 범위&quot;탭의 &quot;0.5&quot;mm에서 데이터 수집 소프트웨어의 스캔 매개 변수를 설정하십시오. 탭, &quot;X- 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;0.5&quot;mm. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향의 스텝 크기를 &quot;0.5&quot;μm로 설정하십시오. 참고 : sy 방향의 tep 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복 속도 (이 경우 2,500 μm / 5,000 Hz = 0.5 μm)로부터 자동으로 결정됩니다. </li></ol></li><li> 스캔하는 동안 데이터가 지속적으로 캡처되어 컴퓨터에 저장되는지 확인하십시오. 참고 : 데이터는 Y 스테이지의 한 방향으로 만 캡처됩니다. </li><li> 컴퓨터에 저장된 다중 B- 스캔 데이터를 사용하여 이미지 처리 소프트웨어 ( 표 2 참조)를 사용하여 최대 진폭 투영 (MAP) 이미지를 검색합니다. </li><li> 스캐닝의 단일 나노 입자 이미지 (여러 이미지 중 하나)를 사용하여 나노 입자 이미지의 중앙 영역을 가로 지르는 선을 수동으로 플롯하여 횡 방향 해상도를 결정하여 가우스 곡선과 같은 점 분산 기능을 얻습니다. 그림 2를 참조하십시오. </li><li> Gau를 사용하여 단일 나노 입자 이미지에서 얻은 점 분산 함수를 맞추십시오.이미지 보정 소프트웨어 ( 표 2 참조)를 사용하여 반값 폭 (FWHM)을 측정합니다. 이것을 가로 해상도로 사용하십시오. 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 깊이 이미징의 대상 개체로 얇게 썬 닭고기 조각에 검은 테이프 조각을 비스듬히 삽입합니다. 테이프가있는 티슈를 물 탱크에 넣으십시오. 참고 : 검은 테이프는 조직에 테이프를 부착하는 데 도움이되는 날카로운 팁이있는 금속판에 붙어 있습니다. </li><li> AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 데이터 수집 소프트웨어에 설정 한 다음 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 단일 B- 스캔 이미지를 캡처하여 최대 이미징 깊이를 결정합니다. <ol><li> &quot;속도&quot;탭에서 &quot;15&quot;mm / s 스캔 속도, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭에서 &quot;1&quot;kHz, &quot;Y 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;5&quot;cm, &quot;0.1&quot; &quot;mm&quot; &quot;X- 스캔 범위&quot;탭에서. 세트그는 &quot;dx&quot;탭에서 &quot;0.1&quot;mm에서 x 방향의 스텝 크기를 나타냅니다. </li></ol></li><li> OR-PAM의 스캔 매개 변수를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 단일 B- 스캔 이미지를 캡처하여 최대 이미징 부서를 결정합니다. <ol><li> &quot;속도&quot;탭에서 &quot;15&quot;mm / s 스캔 속도, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭에서 &quot;5&quot;kHz, &quot;Y- 스캔 범위&quot;에서 &quot;2&quot;cm로 데이터 수집 소프트웨어의 스캔 매개 변수를 설정하십시오. 탭과 &quot;X- 스캔 범위&quot;탭에서 &quot;0.1&quot;mm. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향의 스텝 크기를 &quot;0.1&quot;mm로 설정하십시오. 참고 : X- 스캔 범위와 dx는 동일하므로 하나의 B- 스캔 만 캡처됩니다. 연조직 (1,540m / s)에서의 소리의 속도를 곱한 시간 분해 PA 신호는 A- 라인 이미지를 제공합니다. B- 스캔을 생성하기 위해 Y- 스테이지의 연속 동작 중에 여러 개의 A- 라인이 캡처됩니다. </li></ol></li></ol></li><li> 생체 내 &lt;/ em&gt; 마우스 귀 혈액 혈관계 영상 <ol><li> 몸무게가 25g이고 4 주령의 암컷 마우스를 사용하십시오. </li><li> 복강 내 투여 된 ketamine (120 mg / kg)과 xylazine (16 mg / kg)의 칵테일 (0.1 mL / 10 g의 복용량)을 사용하여 동물을 마취. </li><li> 제모 크림을 사용하여 동물의 귀에서 머리카락을 제거하십시오. 청소 부분을 닦으십시오. 흩어져있는 레이저 빔이 눈에 떨어지는 것을 방지하기 위해 멸균 된 안구 연고로 동물의 눈을가립니다. </li><li> 귀를 위치시키는 소형 플레이트가있는 무대에 동물을 배치하십시오. </li><li> 촬영 기간 동안 흡입 된 isoflurane (1L / min 산소에서 0.75 %)로 마취를 유지하십시오. </li><li> 맥박 산소 측정기를 마우스 다리 또는 꼬리에 고정시키고 생리적 상태를 모니터하십시오. 이미징 영역이 초음파 젤을 사용하여 폴리에틸렌 막과 접촉하도록하십시오. </li><li> AR-PAM의 스캔 파라미터를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작합니다ing. <ol><li> 데이터 수집 소프트웨어의 AR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 &quot;속도&quot;탭에서 &quot;15&quot;mm / s 스캐닝 속도, &quot;펄스 반복률&quot;탭에서 &quot;1&quot;kHz, &quot;펄스 반복 속도&quot;탭에서 &quot;10&quot; Y- 스캔 범위 &quot;탭에서&quot;6mm &quot;를 선택합니다. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향의 스텝 크기를 &quot;30&quot;μm로 설정하십시오. 참고 : y 방향의 스텝 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복 속도 (이 경우 15,000 μm / 1,000 Hz = 15 μm)로부터 자동으로 결정됩니다. </li></ol></li><li> AR-PAM 스캔을 완료 한 후, 이미징 헤드 위치를 AR-PAM에서 OR-PAM으로 전환하십시오 (2 절에서 설명). </li><li> OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 설정하고 &quot;스캔&quot;버튼을 눌러 래스터 스캔을 시작하십시오. <ol><li> &quot;15&quot;mm / s 스캔 속도로 데이터 수집 소프트웨어의 OR-PAM에 대한 스캔 매개 변수를 &quot;속도「Y- 스캔 범위」탭의 「10 mm」, 「X- 스캔 범위」탭의 「6」mm의 순서로 「스텝」사이즈를 설정합니다. &quot;dx&quot;탭에서 x 방향으로 &quot;6&quot;μm로 표시됩니다. 참고 : y 방향의 스텝 크기는 스테이지의 스캔 속도 속도와 펄스 반복 속도 (이 경우 15,000 μm / 5,000 Hz = 2 μm)로부터 자동으로 결정됩니다. </li></ol></li><li> 컴퓨터에 저장된 여러 B- 스캔 데이터를 사용하여 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 MAP 이미지를 검색합니다. </li><li> 전체 이미징 기간 동안 동물을 관찰하십시오. </li></ol></li></ol>

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K., Krishnan, M., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsphere+enabled+sub-diffraction+limited+optical+resolution+photoacoustic+microscopy:+a+simulation+study.">Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study.</a> J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).</li><li>Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+photoacoustic+microscopy+using+photonic+nanojets:+a+simulation+study.">Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study.</a> J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).</li><li>Allen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+fibre+lasers+as+excitation+sources+for+photoacoustic+tomography+and+microscopy+et+al.">Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al.</a> Proc SPIE. , 97080W (2016).</li><li>Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+optical-and+acoustic-resolution+photoacoustic+microscopy+based+on+an+optical+fiber+bundle.">Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle.</a> Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).</li><li>Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optoacoustic+brain+microscopy+with+hybrid+optical+and+acoustic+resolution.">Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution.</a> Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).</li><li>Jeon, S., Kim, J., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+switchable+optica-+and+acoustic+-+resolution+photoacoustic+microscopy.">In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy.</a> Proc SPIE. , 970845 (2016).</li><li>Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+reflection-mode+photoacoustic,+two-photon,+and+second+harmonic+generation+microscopy+in+vivo.">Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo.</a> Sci Rep. 6, 32240 (2016).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay-multiply-and-sum-based+synthetic+aperture+focusing+in+Photoacoustic+microscopy.">Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy.</a> J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANSI+Standard+Z136.1-2000.">ANSI Standard Z136.1-2000.</a> American National Standard for Safe Use of Lasers. , (2000).</li><li>Moothanchery, M., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+Characterization+of+a+Switchable+Acoustic+Resolution+and+Optical+Resolution+Photoacoustic+Microscopy+System.">Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System.</a> Sensors. 17 (2), 357 (2017).</li></ol>

모든 동물 실험은 싱가포르 남양 기술 대학교 (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 된 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 저자는 원고에 관련있는 금전적 이해 관계가없고 공개 할 다른 잠재적 인 이해 상충은 없다.

결론적으로, 낮은 이미징 깊이에서 고해상도 이미징과 높은 이미징 깊이에서 저해상도 이미징을 모두 수행 할 수있는 전환 가능한 AR 및 OR PAM 시스템이 개발되었습니다. 전환 가능한 시스템의 측 해상도와 영상 깊이가 결정되었습니다. 이 전환 가능한 PAM 시스템의 장점은 다음과 같습니다. (1) 엄격한 광학 초점을 사용하는 고해상도 이미징. (2) 음향 집속을 이용한 심 조직 영상; 3) 강력한 PA 신호?...

광학 결맞음 단층 촬영, 공 촛점 현미경 검사 및 다 광자 현미경 검사와 같은 고해상도 광학 이미징 양식은 많은 이점을 가지고 있습니다. 그러나 공간 해상도는 이미징 깊이가 증가함에 따라 크게 감소합니다. 이것은 연조직 1 , 2 에서의 빛 전달의 확산 성 때문입니다. 광학 여기와 초음파 검출의 통합은 깊은 조직에서의 고해상도 광학 이미징의 과제를 극복 할 수있는 솔루션을 제공합니다. Photoacoustic microscopy (PAM)는 다른 광학 이미징 양식보다 더 깊은 이미징을 제공 할 수있는 하나의 모달입니다. 그것은 성공적으로 생체 내 구조, 기능, 분자 및 세포 이미징에 적용되었습니다 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 </sup강한 광 흡수 콘트라스트와 초음파의 높은 공간 해상도를 결합하여&gt; 9 , 10 , 11 , 12 , 13 연구를 수행했습니다. PAM에서 짧은 레이저 펄스가 조직 / 샘플을 조사합니다. 발색단 ( 예 : 멜라닌, 헤모글로빈, 물 등 )에 의한 빛의 흡수는 온도 상승을 일으키며 결과적으로 음향 파 (photoacoustic waves)의 형태로 압력 파를 생성합니다. 생성 된 광 음파는 조직 경계 외부의 광대역 초음파 변환기로 감지 할 수 있습니다. 약한 광학 및 타이트한 음향 집속을 이용하여 음향 해상도 광 음향 현미경 (AR-PAM) 14 , 15 , 16 에서 심 조직 영상을 얻을 수 있습니다. AR에서-PAM, 45 μm의 수평 해상도 및 3 mm까지의 이미징 깊이가 시연되었습니다. 단일 모세관 (~ 5 μm)을 음향 적으로 해결하려면 400 MHz 이상의 중심 주파수에서 작동하는 초음파 변환기가 필요합니다. 이러한 높은 주파수에서, 침투 깊이는 100μm 미만이다. 단단한 음향 집속으로 인한 문제는 엄격한 광학 집속을 사용하여 해결할 수 있습니다. 광학 해상도 광 음향 현미경 (OR-PAM)은 단일 모세관 또는 단일 셀 17 을 분해 할 수 있으며 0.5 μm의 횡 분해능은 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24에 이릅니다 . 광자 나노 젯 (photonic nanojet)을 사용하면 회절 한계 해상도 이상의 해상도를 얻을 수 있습니다.n 25 , 26 . OR-PAM에서, 침투 깊이는 집속 (light focusing)으로 인해 제한되며, 생물학적 조직 ( 23) 내부에서 ~ 1.2mm까지 이미지 할 수 있습니다. 따라서 AR-PAM은 해상도는 더 높지만 해상도는 더 낮을 수 있으며 OR-PAM은 매우 높은 해상도로 이미지를 만들 수 있지만 이미지 깊이는 제한적입니다. AR 및 OR-PAM 시스템의 이미징 속도는 주로 레이저 소스 ( 27) 의 펄스 반복 속도에 의존한다. AR-PAM과 OR-PAM을 결합하면 고해상도와 깊은 이미징을 모두 요구하는 어플리케이션에 큰 도움이됩니다. 이 시스템들을 결합하기위한 노력은 거의 없었다. 일반적으로 이미징에는 2 개의 서로 다른 이미징 스캐너가 사용되므로 샘플을 두 시스템간에 이동해야하므로 생체 내 이미징을 수행하기가 어렵습니다. 그러나 AR 및 OR PAM 모두를 사용한 하이브리드 이미징을 사용하면 확장 가능한 해상도로 이미지를 생성 할 수 있습니다.깊이. 하나의 접근법에서, AR 및 OR PAM 모두에 광을 전달하기 위해 광섬유 번들이 사용된다. 이 접근법에서는 2 개의 개별 레이저 (AR의 경우 570 nm의 고 에너지 레이저와 OR의 경우 532 nm의 저에너지, 높은 반복 속도의 레이저)가 사용되어 시스템이 불편하고 고비용이되었습니다. OR-PAM 레이저 파장은 고정되어 있으며 산소 포화도와 같은 많은 연구는이 결합 시스템을 사용하여 가능하지 않습니다. AR과 OR PAM 사이의 비교 연구는 AR과 OR 사이의 레이저 파장 차이 때문에 가능하지 않습니다. 또한 AR-PAM은 명 시야 조명을 사용합니다. 따라서 피부 표면의 강력한 광 음향 신호가 이미지 품질을 제한합니다. 이러한 이유로이 시스템은 많은 바이오 이미징 응용 프로그램에 사용할 수 없습니다. AR 및 OR PAM을 수행하는 또 다른 접근법에서는 광학 및 초음파 초점이 이동되어 광 초점 및 초음파 초점이 정렬되지 않습니다. 따라서 이미지 품질이 최적이 아닙니다. <sup class = &quot;xref&quot;&gt; 29. 이 기술을 사용하여 AR-PAM 및 OR-PAM은 각각 139 μm 및 21 μm의 해상도를 얻을 수 있기 때문에 해상도가 낮은 시스템입니다. 광섬유 및 시준 광학을 변경하는 것을 포함하는 또 다른 접근 방식은 AR과 OR PAM 사이를 전환하여 정렬 프로세스를 어렵게 만드는 것으로보고되었습니다 30 . 이 모든 경우에 AR-PAM은 암시 야 조명을 사용하지 않았습니다. 암시 야 조명을 사용하면 피부 표면에서 강한 광 음향 신호가 생성되는 것을 줄일 수 있습니다. 따라서 깊은 광 음향 신호의 검출 감도가 명 시야 조명의 감도보다 높기 때문에 링 모양의 조명을 사용하여 심 조직 촬영을 수행 할 수 있습니다. 이 연구는 동일한 레이저 및 스캐너를 사용하여 동일한 샘플을 고해상도 이미징 및 저해상도 심 조직 이미징이 가능한 전환 가능한 AR 및 OR PAM (AR-OR-PAM) 이미징 시스템을보고합니다.ems. AR-OR-PAM 시스템의 성능은 가상 실험을 사용하여 공간 해상도와 영상 깊이를 결정함으로써 특성화되었습니다. 생체 내 혈액 vasculature 이미징은 생물 학적 이미징 능력을 입증하기 위해 마우스 귀에 수행되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="939">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Q-switched Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:232px;">Edgewave</td>
			<td style="width:177px;">BX80-2-L</td>
			<td style="width:227px;">Pump laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Credo-High Repetition Rate Dye Laser</td>
			<td>Spectra physics</td>
			<td style="width:177px;">CREDO-DYE-N</td>
			<td>Dye laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Linear Stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PLS 85&#160;</td>
			<td>XY raster scanning stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>VT 80&#160;</td>
			<td>Confocal determine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounted Silicon photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM05PD1A</td>
			<td>Triggering/Pulse variation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized continuous Rotational stage&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CR1/M-Z7</td>
			<td>Diverting laser beam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounted Continuously Variable ND Filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NDC-50C-4M</td>
			<td>Intensity variable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber Patch Cable</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M29L01</td>
			<td>Multimode fiber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microscope objective</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-10X</td>
			<td>Objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XY translating mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CXY1</td>
			<td>Translating mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Plano convex lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1951</td>
			<td>Collimating lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical lens&#160;</td>
			<td>Altechna</td>
			<td>APX-2-B254</td>
			<td>Ring shape beam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CT1</td>
			<td>Translating stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Optical condenser</td>
			<td style="width:232px;">Home made</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonic transducer</td>
			<td>Olympus-NDT</td>
			<td>V214-BB-RM</td>
			<td>50MHz transducer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Plano concave lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LC4573</td>
			<td>Acoustic lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pulser/Receiver</td>
			<td>Olympus-NDT</td>
			<td>5073PR</td>
			<td>Pulse echo amplifier&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mounted standard iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID12/M</td>
			<td>Beam shaping</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Plano convex lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4327</td>
			<td>Condenser lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mounted precision pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P50S</td>
			<td>Spatial filtering</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Single mode fiber patch cable</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P1-460B-FC-1</td>
			<td>Single mode fiber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Fiber coupler</td>
			<td>Newport</td>
			<td>F-91-C1</td>
			<td>Single mode coupling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:232px;">Edmund Optics</td>
			<td>32-317</td>
			<td>Achromatic doublet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Protected silver elliptical mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PFE10-P01</td>
			<td>Mirror</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Right angle kinematic mirror mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB1</td>
			<td>Mirror mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Z-Axis Translation Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1Z</td>
			<td>z translator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM05L10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">UV Fused Silica Right-Angle Prism</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PS615</td>
			<td>Right angle prism</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Rhomboid prism</td>
			<td style="width:232px;">Edmund Optics</td>
			<td>47-214</td>
			<td>Shear wave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DMPS1M</td>
			<td>Silicon oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Amplifier</td>
			<td>Mini Circuits</td>
			<td>ZFL-500LN</td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">16 bit high speed digitizer</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>M4i.4420</td>
			<td>Data acquisition card</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Oscilloscope</td>
			<td style="width:232px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:177px;">DS06014A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mice&#160;</td>
			<td style="width:232px;">InVivos Pte.Ltd</td>
			<td style="width:177px;">ICR</td>
			<td>Animal model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ultrasound gel&#160;</td>
			<td>Progress/parker acquasonic gel</td>
			<td>PA-GEL-CLEA-5000</td>
			<td>Acoustic coupling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Water tank</td>
			<td style="width:232px;">Home made</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Translation stage</td>
			<td style="width:232px;">Homemade</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>Switching AR-OR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">742031</td>
			<td>Lateral resolution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sterile ocular ointment</td>
			<td style="width:232px;">Alcon</td>
			<td style="width:177px;">Duratears</td>
			<td>Animal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">1951 USAF resolution test target</td>
			<td style="width:232px;">Edmund Optics</td>
			<td align="right" style="width:177px;">38257</td>
			<td>Confocal alignment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Data acquisition software</td>
			<td style="width:232px;">National Instrument</td>
			<td style="width:177px;">Labview</td>
			<td>Home made software using Labview</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Image Processing software</td>
			<td style="width:232px;">Mathworks</td>
			<td style="width:177px;">Matlab</td>
			<td>Home made program using Matlab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

switchable acoustic and optical resolution photoacoustic microscopy for in vivo small-animal blood vasculature imaging

Photoacoustic microscopy (PAM)는 광학 및 초음파를 모두 결합한 빠르게 성장하는 인비 보 이미징 양식으로 고해상도 의 광학 평균 자유 경로 (~ 1 mm 피부)를 넘어서는 침투를 제공합니다. 광학 흡수 콘트라스트와 초음파의 높은 공간 해상도를 단일 양식으로 결합함으로써이 기술은 심부 조직을 투과 할 수 있습니다. 광 음향 현미경 검사 시스템은 음향 해상도가 낮고 탐침 깊이가 크거나 광학 해상도가 높고 탐침을 얕게 가질 수 있습니다. 단일 시스템으로 높은 공간 해상도와 큰 깊이의 침투를 달성하는 것은 어려운 일입니다. 이 작품은 얕은 깊이에서 고해상도 이미징과 생체 내 동일한 샘플의 저해상도 심 조직 이미징이 가능한 AR-OR-PAM 시스템을 제시합니다. 음향 집속을 사용하여 광학 집속을 사용하는 1.4 mm 이미징 깊이와 7.8 mm 이미징 깊이로 45 μm의 측면 해상도를 사용한 4 μm의 측면 해상도결합 된 시스템을 사용하여 시연되었습니다. 여기서 생체 내 소 동물 혈관 조영술은 생물학적 이미징 능력을 입증하기 위해 수행됩니다.

AR-OR-PAM 시스템의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. 이 설정에서 모든 구성 요소는 광학 케이지 설정에서 통합되고 조립되었습니다. 케이지 시스템을 사용하면 AR-OR-PAM 스캐닝 헤드를 소형으로 만들 수 있으며 단일 조립 단계로 쉽게 조립, 정렬 및 통합 할 수 있습니다. 이미지 획득 중에 이미징 헤드의 2...

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Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

여기에는 생체 내 동일한 샘플 에서 심도 깊은 곳에서의 고해상도 이미징과 저해상도 깊은 조직 이미징이 가능한 스위칭 가능한 음향 해상도 (AR) 및 광학 해상도 (OR) 광 음향 현미경 (AR-OR-PAM) 시스템이 시연됩니다.

전환 가능한 음향 및 광학 해상도 Photoacoustic Microscopy for<em&gt; In Vivo</em&gt; 소 동물 혈관 조영술

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

switchable-acoustic-optical-resolution-photoacoustic-microscopy-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

11.8K 조회수.  Nanyang Technological University.  여기에는 생체 내 동일한 샘플 에서 심도 깊은 곳에서의 고해상도 이미징과 저해상도 깊은 조직 이미징이 가능한 스위칭 가능한 음향 해상도 (AR) 및 광학 해상도 (OR) 광 음향 현미경 (AR-OR-PAM) 시스템이 시연됩니다. 

비디오: Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

통합 Photoacoustic Ophthalmoscopy 및 스펙트럼 도메인 광 결맞음 단층 촬영 장치

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality that shows great potential for both preclinical and clinical applications. Conventional optical parametric oscillator-based PAT (OPO-PAT) systems are bulky and expensive and cannot provide high-speed imaging. Recently, pulsed-laser diodes (PLDs) have been successfully demonstrated as an alternative excitation source for PAT. Pulsed-laser diode PAT (PLD-PAT) has been successfully demonstrated for high-speed imaging on photoacoustic phantoms and biological tissues. This work provides a visualized experimental protocol for in vivo brain imaging using PLD-PAT. The protocol includes the compact PLD-PAT system configuration and its description, animal preparation for brain imaging, and a typical experimental procedure for 2D cross-sectional rat brain imaging. The PLD-PAT system is compact and cost-effective and can provide high-speed, high-quality imaging. Brain images collected in vivo at various scan speeds are presented.

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

A compact pulsed-laser diode-based photoacoustic tomography (PLD-PAT) system for high-speed in vivo brain imaging in small animals is demonstrated.

다음을위한 고성능 컴팩트 광 음향 단층 촬영 시스템<em&gt; In Vivo</em&gt; 소형 동물 뇌 영상

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

휴대용 임상 Photoacoustic 실시간 비-침략 적 작은 동물 이미징을 위한 이미징 시스템

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

전환 가능한 음향 및 광학 해상도 Photoacoustic Microscopy for

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