K.A.V.와 P.A.A.의 작품 유럽 연구 위원회 (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), 공학 및 물리 과학 연구 위원회 IB 촉매 상 EP/N013514/1, 그리고 생명 공학 및 생물 과학 연구에 의해 지원 되었다 위원회 (BB/L009722/1 및 BB/N006321/1). 상대습도 정부의 데 많은 y Tecnologìa, 코스타리카 대학, 링컨 대학, 옥스포드에 의해 지원 되었다. 저자 찰리 존스 씨, 씨 찰리 Evans 및 기계 워크숍 (화학과)의 설계 및이 작업에 사용 하는 spectroelectrochemical 세포의 제조에 도움에 대 한 인정 합니다.

1. 혐 기성, 건조 글러브 및 일반적인 실험적인 요구는 FTIR 계의 내부 샘플 실 재현
<ol><li>외부 수은 카드뮴 텔 룰라 이드 (MCT) 검출기와 ATR 액세서리 상업 연결 분석기를 사용 합니다. 건조 한 공기 또는 이질소, 분석기의 시체를 제거 하거나 또는 한 분석기를 사용 하 여 대피 광학 벤치와 함께 합니다.</li>
	<li>혐 기성으로 같은 높이에서 안정, 진동 없는 테이블에 분석기를 배치 (< 1 ppm O2), (노점 <-75 ° C) 글러브를 건조. 충분히 큰 defocused 빔 IR 투명 창을 통해 글러브에는 분석기의 IR 광선을 전환. 참고: 중요 하다 글러브와 분석기 사이의 간격도 제거 또는 대피, NaCl 등 케이시 검 습기 창 소재, 예를 들어 사용 하는 경우에 특히.</li>
	<li>
복제는 글러브 안에 계의 내부 샘플 구획.
	<ol>
<li>이상적으로 계의 내부 초점 거울으로 동일한 초점 거리와 함께 축에서 타원 거울에 글러브 안에 빔 직접. 참고: 그것은 높이 글러브; 내부 조정 IR 광선의 방향으로 수 있도록이 초점 거울 앞에 배치 하는 두 추가 평면 거울에 유용 이 계의 초기 배치에 있는 부정확을 상쇄 된다.</li>
		<li>외부 MCT 발견자, 적당 한 완전 한 글러브, 내부 (짧은 초점 거리 ZnSe 렌즈, 또는 꺼짐-축 포물선 거울, 짧은 초점 거리) 등 시 초점 위치와 같은 내부 샘플의 크기를 복제 분석기의 구획입니다.</li>
		<li>적외선 빔 초점 거울 및 MCT 발견자 사이 대략 등거리 수의 '초점'을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 질소로 외부 MCT 발견자의 dewar 쿨.</li>
	<li>ATR 액세서리 글러브 샘플 구획에 탑재. 입력 및 출력 광학 및 MCT 발견자에 최대 처리량을 달성 하기 위해 ATR 액세서리에 초점을 맞춥니다. 필요한 경우, 검출기 신호의 oversaturation을 조리개 또는 다른 적당 한 감쇠 (와이어 그리드) 등을 사용 합니다. 참고: 위해 데이터 제시 여기, 모든 반사 광학 및 내부 반사 요소 (분노)를 사용 하는 이동식 사다리꼴 시 5-반사 ATR 액세서리 (크리스탈 GmbH, 차원 ca 5 × 8 × 1 m m3, 얼굴 각도 39.5 °). 분노는 폴 리 에테르 에테르 케 톤 (PEEK)에서 가공 하는 이동식 baseplate에 거치 된다.</li>
	<li>글러브를 사용 하 여 외부에서 지 내게 potentiostat 연결할 수 있도록 적당 한 피드스루와 재현된 샘플 구획 집 (가스 꽉 BNC 연결은 유용 하 게이 목적을 위해), 가스 접속과 MCT에서 신호를 전송 하는 케이블 탐지기입니다. 그것은 어떤 소개 또는 측정에 간섭을 피하기 위해 감지기 케이블에 차폐 유지 해야 합니다.</li>
	<li>연동 펌프, 유량 60 mL/min은 글러브 안에 보다 큰 수를 놓습니다. 계의 도식 보기, ATR 액세서리, 연동 펌프 및 potentiostat 설치 그림 1에 표시 됩니다.</li>
	<li>Spectroelectrochemical 셀에에서 표시 된 개요로 그림 2ATR에 물개는 액세서리 등을 생성 합니다. 셀 높은 표면적 카운터 전극 Pt 와이어 (거 즈), 작업 전극 (탄소 막대)과 소형 기준 전극에 대 한 연결을 포함 해야 합니다. 셀은 입구와 셀 통해 솔루션의 빠른 흐름에 대 한 콘센트로 적어도 2 개의 추가 포트를 포함 해야 합니다. 참고: 미니어처 포화 calomel 참조 전극이이 목적을 위해 이상적입니다. 36
</li>
</ol>2. 카본 블랙의 입자 대장균 Hydrogenase 1로의 준비
<ol><li>'젖은' 혐 기성 글러브 혼합 높은 표면적의 20 밀리 그램 카본 블랙의 입자 (> 1000 m3/g) 1 mL 초고 순도 물 (저항력 > 18 m ω c m) microcentrifuge 관에서. 낮은 전력 쥡니다에 의해 입자를 분산 (< 100 W) 적어도 15 분, 또는 때까지 분산 유니폼 이며 약 20 mg/mL에의 한 로드 카본 블랙 분산을 주고 1 시간 안에 침전 하지 않는다.</li>
	<li>
~ 7 mg 단백질/mL의 농도에서 대장균 hydrogenase 1 (Hyd1, 약 50 µ L,55게시 절차 따라 준비)의 약 수를 받아 하 고 (전자 포인트 가까운 pH에서 낮은 이온 강도 버퍼 교환 예를 들어 칼륨 인산 염, 15 m m, pH 5.8, 추가 소금). 최상의 결과 얻기 위해 가능한 활성화 효소 준비 사용 하 여. 농도와 희석 한 적절 한 분자량 컷오프와 원심 필터 장치에 버퍼 교환 (50 kDa 작품 잘 Hyd1에 대 한)을 수행 합니다.
	<ol>
<li>필터 장치에는 Hyd1를 추가 합니다.</li>
		<li>교환 버퍼의 약 450 µ L로 희석.</li>
		<li>온화한 원심 분리를 사용 하 여 50 µ L의 볼륨을 reconcentrate (< ~ 2700 × g) 돌이킬 수 없는 강 수를 방지 하기 위해.</li>
		<li>2.2.2, 2.2.3 단계를 반복 하 여 버퍼 교환 완료 되 면 (일반적으로 이내 ~ 5 주기).</li>
	</ol>
</li>
	<li>버퍼 교환 Hyd1의 50 µ L 약 수 카본 블랙 분산 (2.1에서 준비) 20 mg/mL의 5 µ L 볼륨 믹스. (0 ° C)에서 냉장고에 효소 입자 혼합을 저장 하룻밤 adsorb 효소 수 있도록 합니다. 그것은 때때로 입자 분산 유지 되도록 혼합을 흔들 해야 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge (~ 2700 × g)에서 연속적으로 침전 및 재 분산 주기에 의해 낮은 이온 강도 버퍼 (칼륨 인산 염, 15 m m, pH 5.8, 추가 소금) Hyd1 수정 입자를 씻어. 이 과정을 3-5 회 반복 비 흡착 효소를 제거 하. 참고: 첫 번째 세척 하기 전에 상쾌한 이어야 한다 거의 무색, 효소의 좋은 흡착을 나타내는.</li>
	<li>효소 수정 입자의 ~ 20 mg/mL의 최종 로드를 주고 ~ 5 µ L의 최종 볼륨을 입자를 집중. 참고: Hyd1 수정 입자 경우 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안 그들이 남아 화; 이 가장 ~ 50 µ L의 초고 순도 물 희석 하는 입자를 저장 하 여 이루어집니다.</li>
</ol>3. 대장균 Hydrogenase 1에 PFIRE 측정을 위한 준비
<ol><li>그래서 저전력 쥡니다 (< 100 W), H2에서 처음으로 시 분노를 청소4 (< 90 %w / w) 15 ~ 분, 그리고 HNO3 (70 %w / w)에 대 한 최대 1 시간. 이 청소 절차는 친수성 분노 표면에 연결 되어야 합니다. 분노 피 솔루션에 놓일 수 있습니다 더 청소 하는 것이 필요한 경우 (H2O2의 1:3 비율: H2등4) 어떤 잔여 유기 물질을 산화. 참고: 가혹한 산 성 청소 방법 모든 분노 재료로 사용 하기 위해 적합 한 않을 수 있습니다. 피 라 솔루션 높게 부식성 이며 강한 산화 제, 표면 되어야 합리적으로 깨끗 한 피 솔루션 및 관리의 사용 준비 하는 동안 이동 해야 하기 전에 과정-항상 발열 특성상 피 솔루션의 사용 추가 H2O 2 천천히 H2이렇게4 고 준비, 사용 및 폐기에 대 한 적절 한 안전 절차를 참조 하십시오.</li>
	<li>초고 순도 물에 깨끗 한 분노를 헹 구 고 건조 질소 가스의 흐름에서 건조. 깨끗 한 핀셋을 사용 하 여 오염을 방지 하는 모든 프리즘 처리를 실시 합니다.</li>
	<li>전기 등급 실리콘 실 란 트의 얇은 스트립을 사용 하 여 ATR 액세서리 baseplate에 분노를 봉인. 분노의 가장자리에 실 란 트를 제한 하는 것을 주의. 완전히 건조 실 란 트를 허용 합니다.</li>
	<li>ATR 액세서리 baseplate 분석기 글러브에 전송 그리고 ATR 액세서리에 탑재. 4000-1000 c m-1 4 cm-1 해상도 사용 하 여 표준 급속 사이 참조 (배경) 스펙트럼 측정 검사는 계의 모드와 1024 평균된 interferograms (측정 시간 3-5 분). 입력으로이 스펙트럼을 사용 하 여 실험의 뒷부분에 나오는 흡 광도 스펙트럼의 계산을 허용. 참고: 작은 흡 광도 Hyd1 활성 사이트에 대 한 기대로 인해 그것은 잡음 비율 높은 신호 스펙트럼을 수집 하는 데 필요한.</li>
	<li>미리 준비 된 Hyd1 수정 입자 분산 (제 2)를 포함 하는 '젖은' 글러브 ATR 액세서리 baseplate 전송. 드롭-캐스트는 분노의 큰 얼굴에 입자 분산의 1 µ L 약 수 표면에 걸쳐 균일 하 게 그들을 확산. 참고: 팬 들은 분노에 완전히 건조 될 입자의 정보를 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>M m (즉, ca. 8.2 × 4.9 m m2) 분노의 표면 크기 보다 작은 크기 ~0.1을 연료 전지, 가스 확산 층 재료로 사용 하는 것과 같은 탄소 종이의 한 조각 잘라. 탄소 종이의 표면 영역 드롭 캐스트 Hyd1 수정 입자를 커버 하기에 충분 해야 하지만 이렇게 중복으로 큰 실리콘 실 란 트 사용 하는 분노를 확보. 물, 탄소 종이 담근 다 고 부드럽게 입자 필름 위에 그것을 배치. 탄소 종이 전체 입자 필름에서 좋은 전기 연결을 제공 합니다. 참고: 사전에 여러 조각의 탄소 종이 준비 하 고 미리 '젖은' 혐 기성 글러브 안에 초고 순도 물에 담가 저장에 유리 하다.</li>
	<li>분노를 통해 spectroelectrochemical 셀 (1.7에서 설명 하 고 개요로 그림 2에 표시 된)를 탑재, 나사 baseplate에 그것을 확보. 계속 수산화 효소 실험 버퍼의 ~ 200 µ L를 추가 합니다. 넓은 pH 범위, 버퍼링 수 혼합된 버퍼 시스템 유용 NiFe hydrogenases에 대 한 연구:56 나트륨 아세테이트, 2-[N'-morpholino] 탄 sulfonic 산 (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine-N' -[2 탄-sulfonic 산] (HEPES), N'-트라이앵글 [hydroxymethyl] 메 틸-3-아미노-프로 판-sulfonic 산 (도청), 그리고 2-[N'-cyclohexylamino] 탄 sulfonic 산 (CHES), 15 mM의 최종 농도에 각 구성 요소와 포함 된 0.1 M NaCl 전해질, 산도 pH 6을 사용 하 여 조정 지원 집중 NaOH 및 HCl. 참고: 작업 전극 연결 해야 내 다 약간 탄소 종이 (그림 2)에 좋은 전자 연결 spectroelectrochemical 셀 상단 (~0.1 m m)의 비행기 아래.</li>
	<li>연동 펌프 튜브와 실험 버퍼의 유리병을 포함 하는 흐름 시스템 솔루션 입구와 출구 spectroelectrochemical 셀의 연결. 포함 하는 분석기 '건조' 글러브 조립된 셀 전송.</li>
	<li>Spectroelectrochemical 셀 어셈블리 ATR 액세서리에 장착 합니다. potentiostat에 연결할 작업, 카운터 및 기준 전극. 연동 펌프 튜브 펌프에 연결 합니다.</li>
	<li>4000-1000 c m-1의 스펙트럼 범위 4 cm-1 해상도 1024 평균 interferograms로 흡 광도 스펙트럼을 기록, 참조/배경으로 3.4에서 수집 된 스펙트럼을 사용 하 여. 이 시점에서 스펙트럼 중요 한 포함 한다 (> 100 mO.D.) 아 미드 II ~ 1,540 c m-1 에서 밴드와 Hyd1의 활성 사이트 밴드는 스펙트럼 영역 1,850 2,150 cm-1, 산화, 비활성 상태 (그림 3에서 크게에 분명 해야한다 ).</li>
</ol>4. 대장균 Hydrogenase 1 및 Spectroelectrochemical 셀 테스트 활성화
<ol><li>Hyd1 수정 입자 필름을 감소 잠재력 (−0.8 V vs SCE)를 적용 합니다. Spectroelectrochemical 셀 통해 천천히 H2 와 흐름 버퍼와 실험 버퍼 포화. 예제는 Hyd1를 활성화 완전히 하룻밤 둡니다. 참고: 그것은 중요 한 혐 기성 H2, N2 등, 그래서 모든 혐 기성 가스를 사용 하는 O2 필터를 통해 전달 되어야 합니다.</li>
	<li>활성화 후 샘플의 흡 광도 스펙트럼을 기록 합니다. ΝCO 와 활성 사이트의 vCN 밴드 이제 감소, '활성'의 배포를 표시 합니다. 이것은 스펙트럼 3.10 (그림 4)에 기록 된 상대적인 차이 스펙트럼의 사용을 통해 가장 쉽게 관찰 된다.</li>
	<li>Spectroelectrochemical 셀의 전기 연결을 테스트 합니다. 이 위해 실험 버퍼 N2 가스로 포화. 일련의 산화 (0 V vs SCE)와 Hyd1 수정 입자 필름 (−0.8 V vs SCE) 후보 ( ca 30 분 기간)의 감소를 적용 하 고 각에서 흡 광도 스펙트럼을 기록. Hyd1 해야 될 급속 하 게 산화 하 고 감소, 그리고 입자 영화는 잘 연결 하는 경우 샘플의 100% 적용된 가능성에 응답 해야 합니다.</li>
	<li>실험적인 버퍼의 적절 한 흐름 속도 설정 합니다. 이렇게 하려면 샘플, 감소 잠재력 (−0.8 V vs SCE)를 적용 하 고 실험 버퍼 H2와 함께 포화. -0.707 사이 순환 voltammograms의 일련을 기록-0.039 V vs SCE 10 mV/s 스캔 속도에 점차적으로 H2의 흐름 속도 증가-voltammograms 촉매 형상 평면 회전에서 그를 닮을 때까지 사이 포화 버퍼 디스크 전극55 고 최대 전류는 유량 (그림 5)의 독립. 참고: H2 물에서의 용 해도 293 K와 1 개의 막대기에 ~0.8 m m 이다.</li>
	<li>샘플은 지금 PFIRE 측정을 위한 준비, 스펙트럼 솔루션 조건 (pH, 온도, H2 의 농도 등)의 범위 내에서 전위의 범위에서 수집 합니다. Electrocatalytic 프로세스 Hyd1에 의해 H2 산화 등을 공부 하는 때에 특히 광 및 전기 화학 데이터를 연결할 수 있어야 하는 것이 중요 하다 potentiostat 소프트웨어를 사용 하 여 모든 전기 화학 데이터를 기록 합니다.</li>
</ol>5. 분 광 데이터 처리
<ol><li>그 활성 사이트는 영구적으로 변경 되지 측정 과정 0 V −0.8 V vs 실험의 끝에 SCE에서 스펙트럼을 기록 하 여 확인 합니다. 이러한 스펙트럼 4.3에 기록 된 동일 해야 하 고 활성 사이트의 손실 측정 (그림 6) 동안 관찰 해야 합니다.</li>
	<li>적합 한 형태로 분석기 소프트웨어에서 절대 흡 광도 스펙트럼을 내보내기 (.csv, ASCII, 'matlab', Jcamp 등) 원본 또는 Matlab과 같은 소프트웨어를 사용 하 여 처리를 위해.</li>
	<li>
초기 계획 데이터를 그림 7에 나와 있는 프로세스를 사용 하 여 수정 합니다.
	<ol>
<li>작은 식별 범위 1800 2,150 cm-1에 각 흡 광도 스펙트럼의 두 번째 파생을 받아 (< 1 mO.D입니다.) 액티브 사이트 밴드 높은 곡선 물 배경.</li>
		<li>원래 흡 광도 스펙트럼에 기준선 마커 포인트를 놓고 ' 스냅 ' 실험 스펙트럼에 포인트를 설정 합니다.</li>
		<li>입방 스플라인 보간된 함수 또는 다항식 함수를 사용 하 여 포인트를 통해 기준에 맞게. 이 초기 함수를 실험 데이터에서 뺍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 경쟁 금융 관심을 선언합니다.

PFIRE 산화 환 원 전극 움직일 단백질을 해결 하기 위한 광범위 하 게 적용 가능한 IR 분 광 기술입니다. 특히, 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응 빠른 회전율 조건 하에서 조사 될 수 있습니다. PFIRE 메서드는 PFE 없습니다 직접 구조 정보를 제공 하 고 탄소 전극에 IR 분광학을 커플의 기술에 의해 제공 하는 직접 전기 컨트롤 작성 합니다. PFIRE 접근 따라서 혼자 전기 화학에서 사용할 수 있는 정보에 화학 통찰력을 추가 하 고 공부에 매우 적합 한 산화 단백질 및 효소의 분자 바인딩 및 활성화에 관여. 또한, PFIRE 촉매 회전율의 부재에 있는 단백질에 잠재력 종속 구조 변화에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 비-매출 전자 전송 이벤트 들은 PFE의 '표준' 응용 프로그램을 사용 하 여 감지 하기 어려운 푸리에 변환 AC voltammetry PFE의 확장 큰 성공을. 와 함께 사용 되었습니다. 45 , 46
PFIRE 메서드는, 원칙적으로, PFE를 사용 하 여 공부 될 수 있다 산화 환 원 단백질 든 지의 연구에 적합. 따라서, PFE와 마찬가지로 단백질 흡착 성공적인 PFIRE 실험에 대 한 중요 한 단계입니다. 이 프로토콜에서 우리는 PFIRE 기술 사례 연구로 대장균 Hyd1를 사용 하 여 응용 프로그램을 설명 합니다. 36 , 그러나 43 , 우리는 또한 적용 PFIRE 기술을 R. eutropha,44 에서 세포질 규제 hydrogenase 플 라빈 mononucleotide 카본 블랙에 흡착 하 고. 40 이 모든 경우에 수정 되지 않은 높은 표면적 카본 블랙 (로이 프로토콜에서 설명)을 간단한 물리적 흡착 높은 신호 대 잡음 비율 기록 좋은 품질 적외선 스펙트럼을 충분히 높은 단백질의 표면 적용을 제공 합니다. 흡착의 이러한 높은 레벨을 얻을 수 없는 경우에 그것은 전극 표면에 단백질의 공유 첨부 파일을 허용 하도록 예, 탄소 입자의 표면 수정 해야 합니다. 60 , 61 , 62 PFIRE 측정 한 글러브를 사용 하 여 때만 필요한 공부 샘플을 anaerobically를 처리 해야 합니다. 그러나 매우 일정 한 연습 및 글러브 분위기에서 제공 하는 수증기의 낮은 (< 80 ° C 이슬점) 수준에서 아주 작은 absorbances의 추출 수 있는 높은 신호-잡음 레벨을 제공 합니다. 44 많은 경우에는 혐 기성 환경, 글러브에서 제공 하는 또한 전기 화학 측정 (PFIRE 기술에 통합)에 대 한 바람직한 작업 전극에 O2 감소 때문에 현재를 피하기 위하여.
대량, 실험적인 버퍼에 샘플 흡착은 탄소 입자 IR absorbances 모든 실험 스펙트럼에 크게 기여할 고의 밴드를 겹칠 수 있는 관심, 특히는 아 미드에에서 I, II 및 III의 지역에서 스펙트럼입니다. 63 아 미드 지역에는 또한 flavins 또는 니코틴 cofactors로 기판 및 많은 산화와 감소 반응의 제품 유기 종에서 정보가 들어 있습니다. NiFe hydrogenases의 경우 활성 사이트의 ν ν와공동 CN 밴드 스펙트럼의 상대적으로 명확한 지역에 빠지게 하 고 그래서 PFIRE 기술을 아주 잘이 효소의 연구에 적합 하다. 그러나 다른 경우에, 차이 스펙트럼 동위 원소 라벨 접근 함께 필요할 수 있습니다 변경 고정된 단백질 인 분리. 비슷한 접근 식별, 예를 들어 protonation 변경, 구조상 재배열 하 고 Michaelis Menten 단지 적외선 분광학을 사용 하 여 공부에 사용 되었습니다. 64 , 65 , 66 PFIRE는, 그러므로, hydrogenases의 연구 하지만 모든 산화 단백질 포함 된 (또는 누구의 기판, 제품 또는 억제제 포함)에 적용할 수 있는 그룹 진단 IR 액티브 진동; 일산화 탄소 dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 및 편대 dehydrogenases, 예를 들면.
관련된 기술, 세이 라, 아주 잘 biomimetic 환경에서 막 관련 단백질의 연구에 적합 하다. 32 세이 라 IR 분광학을 또한 ATR IR 구성을 사용 하 여 ATR 프리즘 (분노)의 표면에 분자 내에 있는 가까운 (몇 nm)의 IR 흡 광도 증폭 하는 표면 강화 효과의 사용의 적응 이다. 세이 라 절 묘하게 용 매에서 경쟁 신호에서 상대적으로 자유롭다 흡착된 단백질 및 막 아키텍처 내에서 발생 하는 스펙트럼 변화에 민감한 따라서 이며 기판/억제제 솔루션에서 제시. 이것은 분노의 표면 위에 상당히 큰 침투 깊이에 의존 하는 여기에 설명 된 PFIRE 기술은 달리 약간 (~ 1 μ m), PFIRE는 기판에 더 민감한 의미, 제품 또는 억제제 솔루션에서 제시. 이 증가 감도 '대량' 용 매를 유리할 수 있다; 기판 또는 제품 적외선에 의해 직접 관찰 될 수 있다, PFIRE 스펙트럼 긴 활성 종 및 electrocatalysis 중 관련된 제품 형성의 두 안정 상태 활동에 보고 합니다. 69 기질과 제품의 정상 상태 농도 관찰 하는 능력 (는 CO에 CO2, 강한 적외선 흡수의 가역 산화 catalyzes) 일산화 탄소 효소 등 효소에 대 한 특히 도움이 될 것입니다 또는 (는 CO2편대의 가역 산화 catalyzes) 편대 효소
현재, PFIRE 데이터 수집 및 ATR IR 형상에 대 한 분노의 표면에 효소를 '집중' 하는 데 사용 하는 거시적인 탄소 전극 인 효소 electrocatalysis의 정상 상태 운동 연구로 제한 됩니다. 이 점에서 NiFe hydrogenases의 PFIRE 학문은 빛 트리거 과도 흡수 적외선 분광학을 사용 하 여 하위 매출 달성 속도 론 연구49,50 다이어와 동료 들의 작품을 보완. 작업은 진행 spectroelectrochemical 셀,40 을 소형화 하 고 microelectrodes의 사용으로 달성 해야 마이크로초 순서 시간 분해능. 이 ca 까지 회전율 주파수와 효소에 대 한 하위 매출 달성 속도 론 연구-1100-500의 하면 그리고 감소 그리고 산화 과정의 연구를 수 있게 된다.
전반적으로, PFIRE 정상 상태 조건 하에서 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응의 화학 특성을 허용 하는 광 기술입니다. PFIRE 접근 여러 화학 및 전기 화학 titrations를 단백질의 강력한 흡착을 제공 하는 높은 표면적 전극 사용으로 ATR IR 형상 허용 손쉬운 솔루션 exchange 같은 효소 샘플에 실행 될 수 있습니다. 효소 기능 중 같은 구조 정보를 현장에서 수집 하는 더 넓은 bioelectrochemistry 지역 사회에 대 한 귀중 한 도구입니다.

단백질 기능 연구에 핵심 과제 중 vivo에서 또는 사용 하 여 그들의 생리 적 역할을 수행 하는 단백질의 직접 관찰 절연 단백질 샘플을 허용 하는 현장에서 방법의 개발을 포함 한다. 이 단백질 기능 동시에 측정 하는 동안 컨트롤 또는 트리거링 실험 절차와 평가 될 모두 반응성을 허용 하는 결합 된 기술의 사용 프로세스의 통합 및 개별 화학 단계 필요 합니다. 산화 단백질의 경우이 종종 동일한 정확 하 게 적용 된 잠재력을 제어 하지만 화학적으로 특정에 민감한 분 광 기술로 직접 아무 화학 정보를 제공 하는 전기 화학 기법을 결합 하 변경 연관 단백질 기능입니다. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry는 다양 한 분 광 기술 및 전기 제어의 수준을 포함 하는 결합 된 전기 및 분 광 방법의 범위에 대 한 일반적인 용어입니다. 이 작은 분자를 사용 하 여 전자 전송, UV-표시,4,5 와 결합을 포함 하 여 중재를 연구에 이용 되 고 많은 단백질 인공, 수용 성 전자 기증자와 수락자로 전자를 교환할 수 있습니다. , 6 , 7 자석 원형이 색 성8 및 적외선5,,910,11,12,13,14 (IR) spectroscopies입니다. 제한 된 수의 경우 단백질과 전극 unmediated, 보급 통제 전자 교류를 악용 수 입증 했다. 15 , 16
촉매 반응에 대 한 실시 산화 환 원 효소, 현재의 솔루션 전기 화학 방법에 의해 명확한 불리. 될 가능성이 높습니다 확산 제어 전자 전송을 통해 redox 중재자 솔루션에서 속도 제한. 효소에 대 한 운동 및 기계 정보 손실 될 수 있습니다 또는 적어도 실험 방법에서 발생 하는 확산 유물에서 deconvolute 어려워. 직접, unmediated 전기 제어 따라서 산화 단백질 및 효소의 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 단백질 필름 전기 (PFE)의 기술 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 전극 잠재력의 시리즈에서 편광으로 직접 또는 산화 환 원 공동 인자 단백질 내에서 전자 전송 되는 방식으로 사용 합니다. 17 , 18 , 19 PFE은 산화 환 원 효소에 의해 촉매 산화 또는 감소 반응의 연구에 대 한 특정 값의 계면 전자 전송 매우 높은 속도로 달성 될 수 있다. 예를 들어 Allochromatium vinosum 에서 니켈-철 합금 ([NiFe]) hydrogenase의 electrocatalytic 이직 률 PFE에 의해 H2 산화에 대 한 ca 1000-10000의− 1 로 측정 되었다. 20 잠재적인 전극 촉매 '' 또는 '해제' 및 효소 활동에 electrocatalytic 현재 보고서를 방 아 쇠 역할을 합니다. PFE 잠재력, [페]의 디-철 활성 사이트의 반응 등을 속속들이 의존 하는 복잡 한 효소의 반응성을 분석 하기 위한 유용한 방법 이므로-CO와 O2,21 hydrogenases 또는 잠재력 유도 hydrogenases,22 일산화 탄소 효소,23 및 다른 복잡 한 산화 환 원 효소의 비활성화 반응. 24
산화 환 원 효소, 1-2 pmol cm-2 [NiFe] hydrogenase A. vinosum에서 순서의 낮은 표면 범위에서 발생 하는 주요 장벽 PFE에 의해 받으면 직접 전기 제어와 분 광 기법을 결합 하 대량 금속 전극에 작은 분자 adsorbates의 표면 과학 연구 현장에 상대적인 20 . 이 분 광 측정의 감도 대 한 도전을 선물 한다. 여러 가지 spectroelectrochemical 방법을 보고 되었습니다 공부에 대 한 다양 한 다른 전극에서 산화 환 원 단백질 움직일: 투명 금속 산화물 전극;에서 UV 보이는 분광학 25 , 26 , 금 전극;에서 27 형광 분광학 28 , 29 (세이 라) 표면 강화 된 적외선 흡수 분광학에서 금 전극; 30 , 31 , 32 , 33 그리고 표면 강화 라만 분 광 기술을, 주로 실버 전극. 34 , 35
여기는 커플링 PFE IR 분광학, 단백질 영화 적외선 전기 화학 (PFIRE)로 알려져 있는 기술에 대 한 방법에 설명 합니다. 36 는 PFIRE 메서드는 산화 환 원 효소를 이용 하는 다양 한 탄소 표면에 단백질의 흡착의 용이성 감쇠 총 반사율 (ATR-IR) IR 기하학와 함께에서 높은 표면적 탄소 작업 전극에 움직일 수를 공부 한다. 적외선 분광학은 많은 작은 분자, ligands 및 공동 인자는 반응성, 바인딩, 억제 및 산화 환 원 상태를 평가 하는 데 사용할 수 있는 진단 absorbances 산화 환 원 효소와 단백질의 연구에 유용 합니다. 아니 철 황 센터, flavoproteins,38,,3940 작은 분자 헤 센터 등을37 연구의 바인딩을 등이 있습니다. 41 는 ATR-IR 형상 최적화 된 3-전극 (spectro) 전기 화학 셀42 의 건설을 허용 하 고 따라서 우수한 전기 제어를 제공 합니다. 솔루션 저항 및 잠재적인 드리프트 작업 전극 가까이 참조 전극 배치 하 여 최소화 됩니다. 높은 표면적 카운터 전극 빠른 효소 회전율 작업 전극에 의해 생성 하는 높은 electrocatalytic 전류와 호환 되는 사용 됩니다. Spectroelectrochemical 셀 솔루션의 흐름 손쉬운 제어를 기판, 저 해제 및 pH의 농도 수 있습니다. 36 , 43 , 44 는 PFIRE 메서드는 따라서 IR 스펙트럼이 지속적인된 효소 electrocatalysis 동안 기록 된 위치에 있을 수 있습니다. 36 , 44 PFIRE PFE 산화 환 원 효소에서 이외의 촉매 프로세스에서 정보를 추출이 어려울 수 있습니다 어디 달리 촉매 현재,43 의 부재에 화학 정보를 제공 하는 능력 이기도 합니다. 45 , 46
우리는 [NiFe] hydrogenases, 바이메탈 액티브 사이트에서 Fe를 조정 하는 내장 CO와 CN ligands를 포함 하 여 electrocatalytic H2 산화의 연구에 대 한 PFIRE 메서드를 증명 하고있다. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases는 따라서 PFIRE에 의해 공부 하는 데 특히 적합. PFIRE 메서드를 사용 하면 정상 매출 중 존재 하는 종족에 대 한 정보를 제공 합니다. 및 따라서 실험적인 통제 없이 hydrogenases의 IR 분광학에 문학 부 뿐만 아니라 중요 한 기계적 통찰력을 제공 합니다. 동안 회전율. 47 , 48 다이어와 동료 고용 시간 해결 IR 메서드 NiFe hydrogenases,49,50,51 작은 부정적인 잠재적인 단계 (를 통해 사용 하거나 적용할 빛 방 아 쇠를 사용 하 여 연구를 솔루션 중재자와는 '감 금된' 전자 소스) 또는 photolyse 바운드 수소. PFIRE 메서드를 사용 하면 수 없습니다, 현재 제공 시간 분해능이이 측정에 맞게40 연구 공정의 감소와 산화 촉매, 잘 정의 된 잠재력의 범위에 액세스를 허용 하지 않으며 대량 전송에서 무료 제한입니다.
PFIRE 메서드는 산화 환 원 단백질, 또한 ATR IR 기하학을 사용 하 고 전극 표면에 흡착 분자의 IR 흡 광도 향상 시키기 위해 나노 roughened 금속 전극 사용의 세이 라 연구에 다릅니다. 30 세이 라 막 단백질, 특히 흡착 공부에 대 한 매우 중요 한 기술 또는 모방 막 내 아키텍처,32 그러나 금속 전극에 대 한 필요성 때문에 반응성 기판 및 억제제 범위를 제한할 수 있습니다. 작은 분자 CO, CN-, 공동2 등 을 향한 전극 지원의 양성자 감소와 자기 조립된 단층 탈 착은 매우 부정적인 잠재력에 금속 표면에 문제가 될 수 있습니다,1,52 보호에 효소 electrocatalysis 금속 전극 비록 보고 되었습니다. 53 , 54 세이 라를 기준으로 PFIRE의 단점은 막 단백질 네이티브 또는 모방 멤브레인 구조에 통합의 상대 어려움입니다. 그러나, 경쟁 작은 분자 활성화 반응에 탄소 전극의 상대 화학 inertness는 PFIRE 효소 electrocatalysis, 생물학 산화 환 원에 관련 된 낮은 잠재력 도메인에 특히 공부에 대 한 우수한 기술 hydrogenases에 의해 양성자 감소 등 프로세스입니다. 1 , 43
이 문서의 목표는 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 예를 들어 대장균 에서 NiFe hydrogenase 1 (Hyd1)를 사용 하 여 공부에 대 한 기법으로 PFIRE 메서드를 소개 하는 것입니다. 샘플 준비, 좋은 기질 흐름과 데이터 처리에 대 한 요구의 고려 사항은 설명 합니다. PFIRE은 광범위 하 게 적용 가능한 기술, (와 함께 독특한 IR absorbances) 수 흡착 될 탄소 전극에도 직접 모든 산화 단백질을 공부 하 고 또는 그것으로 전자를 교환할 수 있는 그런 표면 개 질를 사용 하 여 적합된 합니다 전극입니다.

<table><tbody><tr><td>Spectrometer</td><td>Agilent</td><td>680-IR</td><td>with an external MCT detector</td></tr><tr><td>ATR accessory</td><td>Pike Technologies</td><td>GladiATR</td><td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td></tr><tr><td>Glovebox</td><td>Glove Box Technology Ltd.</td><td>N/A</td><td>Custom designed &#039;wet&#039; and &#039;dry&#039; box for anaerobic sample handling and measurement</td></tr><tr><td>KBr window</td><td>Crystran</td><td>Custom</td><td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td></tr><tr><td>Additional optics</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>Components from a PM-IRRAS accessory</td></tr><tr><td>Silicon IRE</td><td>Crystal GmbH</td><td>Custom</td><td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>Metrohm</td><td>Autolab PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Nova 10.1</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Software for controlling the potentiostat</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Williamson Manufacturing Company Ltd</td><td>QL-1000-024-300</td><td></td></tr><tr><td>Pt wire</td><td>Surepure Chemetals</td><td>3272</td><td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td></tr><tr><td>Carbon rod</td><td>WH Smith</td><td>30729209</td><td>0.7 mm HB pencil lead</td></tr><tr><td>Carbon black</td><td>Cabot Corporation</td><td>Black Pearls 2000</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic bath</td><td>Ultrawave</td><td>U100</td><td>35 W</td></tr><tr><td>Centrifugal filter</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5050BK</td><td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>MiniSpin</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher</td><td>S/9240/PB17</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Fisher</td><td>N/2300/PB17</td><td></td></tr><tr><td>silicone sealant</td><td>Cow Corning Toray Co., Ltd.</td><td>SE 4486</td><td></td></tr><tr><td>Carbon paper</td><td>Toray</td><td>TGP-H-030</td><td></td></tr><tr><td>H2 gas</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 gas</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2015</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Data analysis/graphing software</td></tr><tr><td>Resolutions Pro 4.0</td><td>Varian</td><td></td><td>Software for controlling FTIR spectrometer</td></tr></tbody></table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

단백질 내 센터 화학 산화 환 원 정밀 하 게 제어를 제공 하는 산화 환 원 단백질 요구 방법의 이해. 있는 단백질은 움직일 전극 표면에 전극 대체 생리 전자 기증자 또는 수락자, 그런 단백질 필름 전기 화학의 기술을 다양 한 다른의 산화 환 원 반응으로 기능 통찰력 제공 단백질입니다. 전체 화학 이해 전기 제어를 추가 구조 및 기계적 통찰력을 추가할 수 있는 다른 기술로 결합 될 필요 합니다. 여기 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 산화 환 원 단백질의 적외선 분 광 샘플링 단백질 영화 전기 화학을 결합 하 여 설명 합니다. 기술은 높은 표면적 카본 블랙 전극에 움직일 산화 단백질을 다중 반사 감쇠 총 반사율 기하학을 사용 합니다. 흐름의 셀이 전극의 결합 솔루션 pH 또는 용 질 농도를 측정 하는 동안 변경 될 수 있습니다. 이것은 특히 강력한 산화 환 원 효소, 촉매 급속 한 회전율을 지속 수 있으며 촉매 메커니즘에 긴 중간 종의 분 광 관측을 허용 하는 전극에서 제어 해결. 회전율 (H2 산화)와 비-매출 조건에서 대장균 hydrogenase 1에 실험 기술을 설명합니다.

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Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

여기, 우리 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 탄소 전극에 직접 전기 통제 시선 공부 고정된 산화 단백질을 수 있는 설명 합니다. 단일 단백질 시료의 적외선 스펙트럼 적용된 잠재력의 범위는 다양 한 솔루션 조건 아래에 기록할 수 있습니다.

단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H2 산화의 연구에 대 한 설명

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

protein-film-infrared-electrochemistry-demonstrated-for-study-h2

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

12.2K 조회수.  University of Oxford, Inorganic Chemistry Laboratory. 여기, 우리 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 탄소 전극에 직접 전기 통제 시선 공부 고정된 산화 단백질을 수 있는 설명 합니다. 단일 단백질 시료의 적외선 스펙트럼 적용된 잠재력의 범위는 다양 한 솔루션 조건 아래에 기록할 수 있습니다.

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Probing and Mapping Electrode Surfaces in Solid Oxide Fuel Cells

Solid oxide fuel cells (SOFCs) are potentially the most efficient and cost-effective solution to utilization of a wide variety of fuels beyond hydrogen 1-7. The performance of SOFCs and the rates of many chemical and energy transformation processes in energy storage and conversion devices in general are limited primarily by charge and mass transfer along electrode surfaces and across interfaces. Unfortunately, the mechanistic understanding of these processes is still lacking, due largely to the difficulty of characterizing these processes under in situ conditions. This knowledge gap is a chief obstacle to SOFC commercialization. The development of tools for probing and mapping surface chemistries relevant to electrode reactions is vital to unraveling the mechanisms of surface processes and to achieving rational design of new electrode materials for more efficient energy storage and conversion2. Among the relatively few in situ surface analysis methods, Raman spectroscopy can be performed even with high temperatures and harsh atmospheres, making it ideal for characterizing chemical processes relevant to SOFC anode performance and degradation8-12. It can also be used alongside electrochemical measurements, potentially allowing direct correlation of electrochemistry to surface chemistry in an operating cell. Proper in situ Raman mapping measurements would be useful for pin-pointing important anode reaction mechanisms because of its sensitivity to the relevant species, including anode performance degradation through carbon deposition8, 10, 13, 14 ("coking") and sulfur poisoning11, 15 and the manner in which surface modifications stave off this degradation16. The current work demonstrates significant progress towards this capability. In addition, the family of scanning probe microscopy (SPM) techniques provides a special approach to interrogate the electrode surface with nanoscale resolution. Besides the surface topography that is routinely collected by AFM and STM, other properties such as local electronic states, ion diffusion coefficient and surface potential can also be investigated17-22. In this work, electrochemical measurements, Raman spectroscopy, and SPM were used in conjunction with a novel test electrode platform that consists of a Ni mesh electrode embedded in an yttria-stabilized zirconia (YSZ) electrolyte. Cell performance testing and impedance spectroscopy under fuel containing H2S was characterized, and Raman mapping was used to further elucidate the nature of sulfur poisoning. In situ Raman monitoring was used to investigate coking behavior. Finally, atomic force microscopy (AFM) and electrostatic force microscopy (EFM) were used to further visualize carbon deposition on the nanoscale. From this research, we desire to produce a more complete picture of the SOFC anode.

We present a unique platform for characterizing electrode surfaces in solid oxide fuel cells (SOFCs) that allows simultaneous performance of multiple characterization techniques (e.g. in situ Raman spectroscopy and scanning probe microscopy alongside electrochemical measurements). Complementary information from these analyses may help to advance toward a more profound understanding of electrode reaction and degradation mechanisms, providing insights into rational design of better materials for SOFCs.

고체 산화물 연료 전지의 전극 표면을 탐색 및 매핑

Solid oxide fuel cells (SOFCs) are potentially the most efficient and cost-effective solution to utilization of a wide variety of fuels beyond hydrogen ...

연구

공학

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards understanding its mechanism. Protonation and conformational changes affect the vibration pattern of amino acid side chains and of the peptide bond, respectively, both of which can be probed by infrared (IR) difference spectroscopy. For proteins whose function can be repetitively and reproducibly triggered by light, it is possible to obtain infrared difference spectra with (sub)microsecond resolution over a broad spectral range using the step-scan Fourier transform infrared technique. With ~102-103 repetitions of the photoreaction, the minimum number to complete a scan at reasonable spectral resolution and bandwidth, the noise level in the absorption difference spectra can be as low as ~10-4, sufficient to follow the kinetics of protonation changes from a single amino acid. Lower noise levels can be accomplished by more data averaging and/or mathematical processing. The amount of protein required for optimal results is between 5-100 &#181;g, depending on the sampling technique used. Regarding additional requirements, the protein needs to be first concentrated in a low ionic strength buffer and then dried to form a film. The protein film is hydrated prior to the experiment, either with little droplets of water or under controlled atmospheric humidity. The attained hydration level (g of water / g of protein) is gauged from an IR absorption spectrum. To showcase the technique, we studied the photocycle of the light-driven proton-pump bacteriorhodopsin in its native purple membrane environment, and of the light-gated ion channel channelrhodopsin-2 solubilized in detergent.

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel cells.1-3 In most bioelectrochemical applications, enzymes or organelles are immobilized onto an electrode surface with the use of some type of polymer matrix. This polymer scaffold should keep the enzymes stable and allow for the facile diffusion of molecules and ions in and out of the matrix. Most polymers used for this type of immobilization are based on polyamines or polyalcohols - polymers that mimic the natural environment of the enzymes that they encapsulate and stabilize the enzyme through hydrogen or ionic bonding. Another method for stabilizing enzymes involves the use of micelles, which contain hydrophobic regions that can encapsulate and stabilize enzymes.4,5 In particular, the Minteer group has developed a micellar polymer based on commercially available Nafion.6,7 Nafion itself is a micellar polymer that allows for the channel-assisted diffusion of protons and other small cations, but the micelles and channels are extremely small and the polymer is very acidic due to sulfonic acid side chains, which is unfavorable for enzyme immobilization. However, when Nafion is mixed with an excess of hydrophobic alkyl ammonium salts such as tetrabutylammonium bromide (TBAB), the quaternary ammonium cations replace the protons and become the counter ions to the sulfonate groups on the polymer side chains (Figure 1). This results in larger micelles and channels within the polymer that allow for the diffusion of large substrates and ions that are necessary for enzymatic function such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). This modified Nafion polymer has been used to immobilize many different types of enzymes as well as mitochondria for use in biosensors and biofuel cells.8-12 This paper describes a novel procedure for making this micellar polymer enzyme immobilization membrane that can stabilize enzymes. The synthesis of the micellar enzyme immobilization membrane, the procedure for immobilizing enzymes within the membrane, and the assays for studying enzymatic specific activity of the immobilized enzyme are detailed below.

This article will describe the procedure for synthesizing a hydrophobically modified Nafion enzyme immobilization membrane and how to immobilize proteins and/or enzymes within the membrane and test their specific activity.

효소 고정 및 안정화를위한 소수성 소금으로 바뀌었 Nafion

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

생체공학

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. Recycling of the electron donors NADH or NADPH requires the use of additional enzymes and sacrificial substrates. Interestingly, several oxidoreductases accept hydrogen peroxide as electron donor. While being inexpensive, this reagent often reduces the stability of enzymes. A solution to this problem is the in situ generation of the cofactor. The continuous supply of the cofactor at low concentration drives the reaction without impairing enzyme stability. This paper demonstrates a method for the light-catalyzed in situ generation of hydrogen peroxide with the example of the heme-dependent fatty acid decarboxylase OleTJE. The fatty acid decarboxylase OleTJE was discovered due to its unique ability to produce long-chain 1-alkenes from fatty acids, a hitherto unknown enzymatic reaction. 1-alkenes are widely used additives for plasticizers and lubricants. OleTJE has been shown to accept electrons from hydrogen peroxide for the oxidative decarboxylation. While addition of hydrogen peroxide damages the enzyme and results in low yields, in situ generation of the cofactor circumvents this problem. The photobiocatalytic system shows clear advantages regarding enzyme activity and yield, resulting in a simple and efficient system for fatty acid decarboxylation.

We describe a protocol for the light-catalyzed generation of hydrogen peroxide &#8212; a cofactor for oxidative transformations.

라이트 기반 효소 탈 카르 복 실화

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

화학

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

생화학

Iridium Oxide-reduced Graphene Oxide Nanohybrid Thin Film Modified Screen-printed Electrodes as Disposable Electrochemical Paper Microfluidic pH Sensors

A facile, controllable, inexpensive and green electrochemical synthesis of IrO2-graphene nanohybrid thin films is developed to fabricate an easy-to-use integrated paper microfluidic electrochemical pH sensor for resource-limited settings. Taking advantages from both pH meters and strips, the pH sensing platform is composed of hydrophobic barrier-patterned paper micropad (&#181;PAD) using polydimethylsiloxane (PDMS), screen-printed electrode (SPE) modified with IrO2-graphene films and molded acrylonitrile butadiene styrene (ABS) plastic holder. Repetitive cathodic potential cycling was employed for graphene oxide (GO) reduction which can completely remove electrochemically unstable oxygenated groups and generate a 2D defect-free homogeneous graphene thin film with excellent stability and electronic properties. A uniform and smooth IrO2 film in nanoscale grain size is anodically electrodeposited onto the graphene film, without any observable cracks. The resulting IrO2-RGO electrode showed slightly super-Nernstian responses from pH 2-12 in Britton-Robinson (B-R) buffers with good linearity, small hysteresis, low response time and reproducibility in different buffers, as well as low sensitivities to different interfering ionic species and dissolved oxygen. A simple portable digital pH meter is fabricated, whose signal is measured with a multimeter, using high input-impedance operational amplifier and consumer batteries. The pH values measured with the portable electrochemical paper-microfluidic pH sensors were consistent with those measured using a commercial laboratory pH meter with a glass electrode.

The study demonstrates the growth of iridium oxide-reduced graphene oxide (IrO2-RGO) nanohybrid thin films on irregular and rough screen-printed carbon substrate through a green electrochemical synthesis, and their implementation as a pH sensor with a patterned paper-fluidic platform.

일회용 전기 종이 마이크로 유체의 pH 센서와 같은 이리듐 산화물 환원 그래 핀 산화물 나노 하이브리드 박막 수정 스크린 인쇄 전극

A facile, controllable, inexpensive and green electrochemical synthesis of IrO2-graphene nanohybrid thin films is developed to fabricate an easy-to-use ...

Synthesis and Performance Characterizations of Transition Metal Single Atom Catalyst for Electrochemical CO2 Reduction

This protocol presents both the synthesis method of the Ni single atom catalyst, and the electrochemical testing of its catalytic activity and selectivity in aqueous CO2 reduction. Different from traditional metal nanocrystals, the synthesis of metal single atoms involves a matrix material that can confine those single atoms and prevent them from aggregation. We report an electrospinning and thermal annealing method to prepare Ni single atoms dispersed and coordinated in a graphene shell, as active centers for CO2 reduction to CO. During the synthesis, N dopants play a critical role in generating graphene vacancies to trap Ni atoms. Aberration-corrected scanning transmission electron microscopy and three-dimensional atom probe tomography were employed to identify the single Ni atomic sites in graphene vacancies. Detailed setup of electrochemical CO2 reduction apparatus coupled with an on-line gas chromatography is also demonstrated. Compared to metallic Ni, Ni single atom catalyst exhibit dramatically improved CO2 reduction and suppressed H2 evolution side reaction.

Synthesis and Performance Characterizations of Transition Metal Single Atom Catalyst for Electrochemical CO2 Reduction

Here, we present a protocol for the synthesis and electrochemical testing of transition metal single atoms coordinated in graphene vacancies as active centers for selective carbon dioxide reduction to carbon monoxide in aqueous solutions.

합성 및 전기 화학적 CO2 감소를 위한 전이 금속 단일 원자 촉매의 성능 Characterizations

This protocol presents both the synthesis method of the Ni single atom catalyst, and the electrochemical testing of its catalytic activity and selectivity ...

Developing Photosensitizer-Cobaloxime Hybrids for Solar-Driven H2 Production in Aqueous Aerobic Conditions

Developing photocatalytic H2 production devices is the one of the key steps for constructing a global H2-based renewable energy infrastructure. A number of photoactive assemblies have emerged where a photosensitizer and cobaloxime-based H2 production catalysts work in tandem to convert light energy into the H-H chemical bonds. However, the long-term instability of these assemblies and the need for hazardous proton sources have limited their usage. Here, in this work, we have integrated a stilbene-based organic dye into the periphery of a cobaloxime core via a distinct axial pyridine linkage. This strategy allowed us to develop a photosensitizer-catalyst hybrid structure with the same molecular framework. In this article, we have explained the detailed procedure of the synthesis of this hybrid molecule in addition to its comprehensive chemical characterization. The structural and optical studies have exhibited an intense electronic interaction between the cobaloxime core and the organic photosensitizer. The cobaloxime was active for H2 production even in the presence of water as the proton source. Here, we have developed a simple airtight system connected with an online H2 detector for the investigation of the photocatalytic activity by this hybrid complex. This photosensitizer-catalyst dyad present in the experimental setup continuously produced H2 once it was exposed in the natural sunlight. This photocatalytic H2 production by the hybrid complex was observed in aqueous/organic mixture media in the presence of a sacrificial electron donor under complete aerobic conditions. Thus, this photocatalysis measurement system along with the photosensitizer-catalyst dyad provide valuable insight for the development of next generation photocatalytic H2 production devices.

Developing Photosensitizer-Cobaloxime Hybrids for Solar-Driven H2 Production in Aqueous Aerobic Conditions

We have directly incorporated a stilbene-based organic dye into a cobaloxime core to generate a photosensitizer-catalyst dyad for photocatalytic H2 production. We have also developed a simple experimental setup for evaluating the light-driven H2 production by photocatalytic assemblies.

수성 에어로빅 조건에서 태양광 구동 H2 생산을 위한 광전지-코발록시메 하이브리드 개발

Developing photocatalytic H2 production devices is the one of the key steps for constructing a global H2-based renewable energy infrastructure. A number ...

Catalytic Reactions at Amine-Stabilized and Ligand-Free Platinum Nanoparticles Supported on Titania During Hydrogenation of Alkenes and Aldehydes

Ligands like amines are used in the colloidal synthesis approach to protect platinum nanoparticles (Pt NP&#39;s) from agglomeration. Normally, ligands like amines are removed by diverse pre-treatment procedures before use in heterogeneous catalysis as amines are considered as a catalyst poison. However, a possible beneficial influence of these surface modifiers on hydrogenation reactions, which is known from spectator species on metal surfaces, is often neglected.
Therefore, amine-stabilized Pt nanoparticles supported by titania (P25) were used without any pre-treatment in order to elucidate a possible influence of the ligand in liquid phase hydrogenation reactions. The catalytic activity of amine-stabilized Pt nanoparticles of two different sizes was investigated in a double-walled stirring tank reactor at 69 &#176;C to 130 &#176;C and 1 atm hydrogen pressure. The conversion of cyclohexene to cyclohexane was determined by gas chromatography (GC) and was compared to ligand-free Pt particles. All catalysts were checked before and after reaction by transmission electron spectroscopy (TEM) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) for possible changes in size, shape, and ligand shell. The hydrogenation of cyclohexene in liquid phase revealed a higher conversion for amine-stabilized Pt nanoparticles on titania than the ligand-free particles. The hydrogenation of 5-methylfurfural (5-MF) was chosen for a further test reaction, since the hydrogenation of &#945;, &#946;-unsaturated aldehydes is more complex and exhibits various reaction paths. However, XPS and infrared spectroscopy (IR) proved that 5-MF acts as catalyst poison at the given reaction conditions.

This protocol shows a convenient method for comparing the catalytic properties of supported platinum catalysts, synthesized by deposition of nanosized colloids or by impregnation. The hydrogenation of cyclohexene serves as a model reaction to determine the catalytic activity of the catalysts.

알켄과 알데히드의 수소화 동안 티타니아에 지지된 아민 안정화 및 리간드가 없는 백금 나노입자에서의 촉매 반응

Ligands like amines are used in the colloidal synthesis approach to protect platinum nanoparticles (Pt NP&#39;s) from agglomeration. Normally, ligands ...

Hydrogen Production and Utilization in a Membrane Reactor

Industrial hydrogenation consumes ~11 Mt of fossil-derived H2 gas yearly. Our group invented a membrane reactor to bypass the need to use H2 gas for hydrogenation chemistry. The membrane reactor sources hydrogen from water and drives reactions using renewable electricity. In this reactor, a thin piece of Pd separates an electrochemical hydrogen production compartment from a chemical hydrogenation compartment. The Pd in the membrane reactor acts as (i) a hydrogen-selective membrane, (ii) a cathode, and (iii) a catalyst for hydrogenation. Herein, we report the use of atmospheric mass spectrometry (atm-MS) and gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) to demonstrate that an applied electrochemical bias across a Pd membrane enables efficient hydrogenation without direct H2 input in a membrane reactor. With atm-MS, we measured a hydrogen permeation of 73%, which enabled the hydrogenation of propiophenone to propylbenzene with 100% selectivity, as measured by GC-MS. In contrast to conventional electrochemical hydrogenation, which is limited to low concentrations of starting material dissolved in a protic electrolyte, the physical separation of hydrogen production from utilization in the membrane reactor enables hydrogenation in any solvent or at any concentration. The use of high concentrations and a wide range of solvents is particularly important for reactor scalability and future commercialization.

Membrane reactors enable hydrogenation in ambient conditions without direct H2 input. We can track the hydrogen production and utilization in these systems using atmospheric mass spectrometry (atm-MS) and gas chromatography mass spectrometry (GC-MS).

멤브레인 반응기에서의 수소 생산 및 활용

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단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H₂ 산화의 연구에 대 한 설명

요약

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수성 에어로빅 조건에서 태양광 구동 H₂ 생산을 위한 광전지-코발록시메 하이브리드 개발

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