이 작품 일부에 의해 지원 되었다 프로젝트 암 치료제 (P-직접) (K.M. 15cm0106102h0002) 및 프로젝트에 혁신적인 연구 개발에 대 한 암 연구 및 치료 진화 (P-만들기) (16 cm 01061150001, K.M.) 일본 기관에서 의료 연구 및 개발, 아메드; 다케다 과학 재단 (사원); 부여 공주 다카마쓰 암 연구 기금 (13-24520, 사원); 그리고 JSP KAKENHI 보조금 번호 JP16K07133 (사원).

1. 시 약 설치
<ol><li>
셀 동기화에 사용 하는 시 약
	<ol>
<li>2.5 m m 티 미 딘을 포함 하는 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)를 생성 하려면 125 m m 티 미 딘 준비 조직 문화 학년 물 1 mL 당 티 미 딘의 30.28 mg을 디졸브. 여과 0.22 μ m 주사기 필터 장치 솔루션. DMEM 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보완의 50 mL 당 갓된 125 m m 티 미 딘 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Nocodazole의 0.1 μ g/mL를 포함 된 DMEM을 생성 하기 위해 디 메 틸 sulfoxide 5 μ g/μ nocodazole 준비를 (DMSO)에 nocodazole 분해. 추가 5 µ g의 1 µ L / µ L nocodazole DMEM의 50 mL 당 10% (vol/vol) FBS 보충.</li>
		<li>DMEM 포함 된 DMSO의 0.002% (vol/vol)를 생성 하려면 DMEM 10% (vol/vol) FBS와 보충의 50 mL 당 DMSO의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IP RdRP 분석 결과 대 한 사용 시 약
	<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼 a: 150 m m NaCl, 20 mM Tris HCl (pH 7.4) 준비 및 0.5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>아세테이트 버퍼 x 5를 준비: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic 산 (HEPES)-코 (pH 7.8), 500mm 칼륨 아세테이트 및 20 m m MgCl2. 실 온에서 시 약 저장.</li>
		<li>워시 버퍼 1: 1 x 아세테이트 버퍼, 글리세롤 10% (vol/vol), 0.1% (vol/vol) 트라이 톤 X-100 0.06 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일, ethylenediamenetetraacetic 산 (EDTA) 준비-무료. 사용의 일 또는 사용 하기 전에 하루에 워시 버퍼 1을 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>AGC 솔루션 준비: 아세테이트 버퍼, 10% (vol/vol) 글리세롤과 0.02% (wt/vol) 3 [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio x 1]-1-propanesulfonat (챕). 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>2mm CaCl2를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면 1 M CaCl2 AGC 솔루션 50 mL 당 100 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>3mm 에틸렌 글리콜 bis (b-aminoethylether)를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면-N, N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA), AGC 솔루션 50 mL 당 0.4 M EGTA (pH 7.5)의 375 µ L 추가. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>워시 버퍼 2: 1 x 아세테이트 버퍼와 0.02% (wt/vol) 챕 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>HMD 솔루션 준비: 0.2 M HEPES-코 (pH 7.8), 40 m m MgCl2 와 2 mM dithiothreitol (DTT). -20 ° c.에 시 약 저장 참고: HMD 솔루션 3 개월에서 이상 갱신 수 한다.</li>
		<li>가수분해 K 버퍼 x 2 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS). -20 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>버퍼를 로드 x 2 준비: 95% (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 오렌지 G. 저장-20 ° c.에 시 약</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. HeLa 세포의 준비
참고: 준비 HeLa 세포 mitotic 단계 (조작) 또는 비동기적으로 나누어 동기화 (unmanipulated). 37 ° c.에 5% CO2 의 셀 문화
<ol><li>
헬러 세포 유사 분열에서의 동기화
	<ol>
<li>플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께.</li>
		<li>이틀 후 도금, 2.5 m m 티 미 딘 및 10% (vol/vol) FBS DMEM의 10 mL 매체를 바꿉니다. 24 h에 대 한 셀을 문화.</li>
		<li>세 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (-)의 10 mL로 세포 세척 하 고 10% (vol/vol) FBS 6 h에 대 한 포함 된 DMEM의 10 mL로 세포 문화.</li>
		<li>Nocodazole의 10% (vol/vol) FBS, 0.1 µ g/mL를 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화.</li>
		<li>부드럽게, 문화 접시를 흔들어 하 고 분리 mitotic 세포를 포함 하는 상쾌한을 검색 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제. 참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Unmanipulated HeLa 세포의 준비
	<ol>
<li>플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께.</li>
		<li>도금, 후에 2 일 10 mL의 10% (vol/vol) FBS 포함 된 DMEM 매체를 바꿉니다. 문화 30 h 세포.</li>
		<li>0.002% (vol/vol) DMSO 10% (vol/vol) FBS, 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화.</li>
		<li>Trypsinization 1 mM EDTA를 포함 하는 트립 신 (2.5 g/L)의 0.7 mL을 사용 하 여 셀을 수집 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제. 참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP RdRP 분석 결과
<ol><li>단백질 A agarose 구슬 준비
	<ol>
<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 선호도 수 지의 1 mL (침대 볼륨 500 µ L)를 전송. 4 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>구슬, 하의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 (총 세 세척)를 반복 합니다.</li>
		<li>구슬에의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L를 추가, 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 회전 통에 4 ° C에서 튜브 하룻밤 (또는 적어도 4 h) 회전 합니다.</li>
		<li>4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 튜브 원심 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>구슬에 세포의 용 해 버퍼 A의 500 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° c.에 구슬 저장</li>
	</ol></li>
	<li>세포 lysate의 준비
	<ol>
<li>(선택 사항) 셀 2 단계에서 고정 되어 셀 느슨하게 될 때까지 얼음에 냉동된 세포를 녹여 놓고.</li>
		<li>셀 10 mL의 PBS (-)을 한 번 씻어. 1450 x g 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>부드러운 pipetting으로 얼음 세포의 용 해 버퍼의 세포의 용 해 버퍼 A 1 x 107 셀의 당 (1 mL)으로 세포를 lyse.</li>
		<li>다음 조건; 1.5 mL 튜브에 샘플을 sonicate 25%는 sonicator의 증폭을 설정 하 고 10 sonicate s.</li>
		<li>4 ° c.에 15 분 동안 20400 x g 에서 샘플을 원심</li>
		<li>상쾌한을 수집 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의 1 mL를 각각을 전송 합니다. 주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitation
	<ol>
<li>사전 취소 단계의 3.2.6 lysate 40 µ L (구슬 볼륨 20 µ L)를 추가 하 여은 lysate의 1 mL 당 prewashed 단백질 A agarose 구슬의. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 30 분에서 4 ° c.에 대 한 샘플을 회전</li>
		<li>13000 x g 4 ° C에서 1 분 동안에 샘플 원심 고 복구는 상쾌한.</li>
		<li>40 µ (침대 볼륨 20 µ L) L prewashed 단백질 A agarose 구슬 및 안티 인간 TERT 항 체의 10 µ g의 추가 (복제: 10E9-2)8 에 사전 허가 lysate. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 밤에 4 ° C에서 샘플을 회전.</li>
		<li>3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>워시 워시 버퍼 1 구슬: 구슬에 워시 버퍼 1의 1 mL을 추가, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 및 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 3 추가 시간이이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>AGC 솔루션 2mm CaCl2를 포함 하는 구슬 한번 세척: AGC 솔루션 2mm CaCl2 구슬에 포함 된의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>Micrococcal nuclease (MNase)와 구슬 치료: 표 1에 설명 된 MNase 반응 혼합물을 준비. 부드러운 pipetting으로 구슬 MNase 반응 혼합물의 60 µ L에서 resuspend. 흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 25 ° c.에 15 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에 참고: 기복이 셰이 커를 사용 하 여이 단계에서 속도 제한에 따라 엄격 하 게 매우 중요 하다. 동영상, 회전 믹서 등의 다른 유형을 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>구슬 3mm EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션 두 번 세척: 구슬 3 m m EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>워시 워시 버퍼 2 한번 구슬: 워시 버퍼 2의 1 mL를 추가구슬, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 하 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. RdRP 반응을 설정 하는 동안 얼음에 비즈를 유지. 주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RdRP 반응
	<ol>
<li>표 2에 설명 된 대로 새로운 튜브에서 RdRP 반응 혼합물을 준비 합니다.</li>
		<li>[Α-32P]의 6 µ L 추가 UTP (3000 Ci/mmol) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합. 참고: [α-32P] ATP, [α-32P] CTP, 또는 [α-32P] GTP [α-32P] 대신 반응에 사용 될 수 있다 광섬유.</li>
		<li>템플릿 RNA의 1 µ L를 추가 (1 µ g / µ L) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합. 참고: 설정 하려면 RdRP 분석 결과, 다음 RNA 서식 파일 것이 좋습니다: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>단계의 3.4.3 RdRP 반응 혼합물의 20 µ L와 구슬 pipetting으로 resuspend.</li>
		<li>흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 32 ° c.에 2 h 형 peltier 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에</li>
		<li>가수분해 K (20 mg/mL)의 5.4 µ L과 2 x 가수분해 K 버퍼의 45.4 µ L 반응 혼합물에 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 턴테이블에 샘플 (20 ~ 25 rpm)를 흔들어</li>
		<li>샘플에 RNase 무료 물 109.2 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 하 고 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플을 다음 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트의 추가 (pH = 5.2), 4 강 수 캐리어와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 µ L. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>-20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조. 주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다. 참고: 단계 3.4.11에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안.</li>
	</ol></li>
	<li>RNase 처리
	<ol>
<li>RNase 무료 물 단계 3.4.11에서 20 µ L에서 펠 릿 resuspend</li>
		<li>표 3에 설명 된 대로 새로운 튜브에 RNase 반응 혼합물을 준비 합니다.</li>
		<li>샘플, RNase 반응 혼합물의 180 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 2 h에 대 한 튜브를 품 어</li>
		<li>샘플을 10% (vol/vol) SDS의 2.3 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
		<li>샘플을 가수분해 K (20 mg/mL)의 2 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
		<li>샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 205 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 후 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송.</li>
		<li>3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2), 강 수의 4 µ L와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>-20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조. 참고: 단계 3.5.9에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안.</li>
	</ol></li>
	<li>젤 전기 이동 법 그리고 autoradiography
	<ol>
<li>RNase 무료 물 20 µ L와 샘플 resuspend</li>
		<li>버퍼를 로드 x 2의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>95 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 끓여 얼음에 샘플을 짝사랑.</li>
		<li>젤을 실행 합니다. 서식 파일 크기 34 국세청 (단계 3.4.3 참조) 경우, 7 M 요소-10 %polyacrylamide 젤 젤 전기 이동 법을 변성 시키기 위해 사용 된다.</li>
		<li>젤 젤 건조 기 건조.</li>
		<li>x-레이 카세트-80 ° c.에 강화 화면 내에서 건조 젤을 영화 노출</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

IP RdRP 분석 결과 인간 TERT의 RdRP 활동을 감지 하는 중요 한 방법입니다. TERT 단백질 높은 mitotic HeLa 세포, TERT RdRP 복잡 한8,,910을 형성에 표현 된다. 이 mitotic는 HeLa 세포 RdRP 활동을 감지 하는 최적의 자료는 건의 한다. 위에서 설명한 프로토콜, mitotic 그리고 비 동기화 HeLa 세포 포함 됩니다 긍정 및 부정적인 예제로 각각. 그림 1A에서 같이, mitotic는 HeLa 세포에서 권장 RNA 템플릿에서 RdRP 분석 결과 제품 20 ~ 30 사이의 광범위 한 방사성 신호 표시 nt. HeLa 세포 이외에 우리 셀 라인의 종류와 시험 수행 있고 다른 세포 유형9에 신호 패턴을 변경할 수 있습니다 발견: 일부 강한 신호만 약 30 표시 nt, 일부는 HeLa 세포와 비슷한 패턴을 보여. 우리는 짧은 RNA는 34 nt 템플릿8, 이외 템플릿 분석 결과 수행도 하 고 긴 (~ 300 nt) 다양 한 시퀀스, RNAs 성공적으로 일부 선호 있을 수 있지만 해당 서식 파일에서 RdRP 제품을 얻을. 그러나 첫 번째 재판에 대 한, 좋습니다 mitotic 단계에 34 nt RNA 템플릿을 HeLa 세포를 사용 하 여. 뇌관-종속 및 뇌관-독립적인 방식으로11RdRPs 이중 가닥 RNA를 생성할 수 있습니다. 우리 보고 TERT 인간 RdRP7,9;이 속성 유지 TERT 다시 못쓰게 메커니즘73'-폴드 구조 RNA 템플릿에서 dsRNA를 합성. 34 nt RNA 서식 파일, TERT 뇌관9를 사용 하지 않고 보완 가닥을 합성. 특히 RdRP 제품 뇌관-독립적인 방식으로, 즉 드 노 보 합성 RNA 제품, [α-32P] 합성을 검출 하기 위하여 NTP [γ-32P]로 대체 될 수 있다 NTP RdRP 반응9에.
TERT 구슬에 면역성이 있는 복합물의 MNase 처리는 원하는 결과 달성 하기 위해 중요 한 단계 이다. 너무 오래 또는 집중 떨고 MNase 치료를 수행 하는 경우 RdRP 제품 현저 하 게 감소 것입니다. 이러한 문제를 방지 하려면 좋습니다 엄격 하 게 신중 하 게 프로토콜을 따라. HMD 솔루션 성공 위한 또 다른 중요 한 요소 이다입니다. 신호는 매우 약한 찾을, 새로 준비 한 HMD 솔루션을 교체 합니다.
프로토콜을 통해 하나 RNase 오염을 피하기 위해 주의 해야한다. Ribonuclease 치료 전용 장비로 수행 되어야 한다. Ribonuclease 조작 후 팁 삭제 해야 하나 그리고 RNase와 튜브 즉시, 전문 솔루션 (예: RNase 조용한), RNase 제거 나무를 변경.
TERT TERC 뿐만 아니라 생 RNAs의 또한 많은 종류와 상호 작용 하 고 우리가7그들의 부분을 보고 있다. MNase 치료 없이 IP RdRP 분석 결과 같은 IP RdRP 분석 결과에서 수정 그들의 시퀀스 기능에 생 RNA 템플릿 RdRP TERT-관련 활동과 bioinformatic 가이드에 대 한 전체 목록을 제공 합니다. 우리가 성공적으로 조직 lysate에이 프로토콜을 적용 했습니다. TERT 정상 및 종양 직물의 다양 한 표현 때문에이 분석 결과 인간의 TERT의 비정규 효소 기능을 조사 하기 위해 유용할 수 있습니다.

인간의 telomerase 역전사 (TERT) 잘 알려져, telomerase의 촉매 소 단위 이며 그것 elongates telomere telomerase RNA 구성 요소 (TERC), 특정 RNA 템플릿1을 사용 하 여. TERT telomerase의 구성 요소로 서 telomeric DNA polymerizes, 비록 구조 및 계통 발생 분석 나타냅니다 TERT 바이러스 역전사 바이러스 성 RNA 의존 RNA polymerases (RdRPs)와 밀접 하 게 관련 된 도메인을 공유 이러한 polymerases2,,34. RdRP 보완 RNA 가닥 RNA 서식 파일을 생성 하는 효소 이다. 효소는 바이러스 뿐만 아니라 모델 생물, 식물, 효 모, 벌레, 등 에서도 인코딩되고 RdRP에 의해 이중 가닥 RNA 합성 transcriptional 및 post-transcriptional 유전자가 유기 체5,6 침묵에 기여 . 인간의 RdRP 오랜 시간 동안 실종 됐다, 하지만 우리는 인간 TERT 20097에서 RdRP 활동을 발견.
우리는 먼저 재조합 단백질7, TERT의 RdRP 활동을 확인 후 민감한 생체 외에서 분석 결과 내 생 TERT8RdRP 활동 감지를 설립. 여기, 우리가 시험관에 RdRP 분석 결과 (분석 결과 IP RdRP) 생 TERT에 대 한 보여 줍니다. 이 방법은 생 TERT의 immunoprecipitation (IP)로 시작 하 고 뒤에 있는 방사성 ribonucleotides는 초기 RNA 가닥에 통합 RdRP 반응, 생체 외에서 .

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin mixed solution</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&amp;bull;6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&amp;bull;2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Use fresh RI for the assay</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, deionized</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>EX-135</td><td>For step B)</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., KUBOTA</td><td>3740</td><td>For step 6.2</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>MX-305</td><td>For step 6.5</td></tr><tr><td>Cooled incubator</td><td>e.g., Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Set a rotary shaker inside</td></tr><tr><td>Rotary shaker</td><td>e.g., TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Cooled incubator&amp;nbsp;</td><td>e.g., TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>e.g., TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Block incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein

인간의 telomerase 역전사 (TERT), telomerase의 촉매 소 단위 이며 그것 elongates telomere RNA 의존 DNA 중 합 효소 활동을 통해. TERT는 역전사로 지명 된다, 비록 TERT의 구조 및 계통 발생 분석 TERT 오른 손잡이 polymerases의 회원 이며, 뿐만 아니라 바이러스 역전사 바이러스 성 RNA 의존 RNA polymerases (RdRPs)에 관한 설명. 우리는 첫째로 RdRP 무료 한 RNA를 생성 하는 인간 TERT의 활동 비 코딩 RNA 서식 서 암 세포에 침묵 하는 RNA에 기여 하 고 식별. 이 정식이 아닌 효소 활동 분석, 우리 2009 년에서 재조합 TERT 분석 결과 RdRP를 개발, 그 후 생 TERT RdRP 시험 생체 외에서 설립. 이 원고에서 우리는 후자의 방법을 설명합니다. 간단히, TERT 면역성이 있는 복합물 셀에서 격리 되며 RNA 템플릿과 RdRP 반응에 대 한 방사성 rNTP를 포함 하 여 rNTPs와 알을 품을. 단일 가닥 RNA를 제거 하려면 반응 제품, 그리고 최종 제품 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 분석은 RNase 처리 됩니다. 방사선된 RdRP 제품 하룻밤 노출 후 autoradiography 하 여 검색할 수 있습니다.

권장된 RNA 템플릿을 사용 하 여 방사성 RdRP 제품 하룻밤 노출 (그림 1A) 후 mitotic 단계에서 특히 HeLa 세포에서에서 20 ~ 30 뉴클레오티드 (nt) 사이 관찰 된다. RdRP 제품의 신호 강도 약 25 위치 두 봉우리를 설명 하는 일반적으로, 제품의 크기 분포와 협 화음에 nt 다음 세대 시퀀싱9에의해 확인 nt와 30. Mitotic 세포는 달리 동기화 없이 HeLa 세포는 거의 20-30 nt 방사성 제품의 부재를 보여 줍니다. 타원형 신호 20 아래 배치 된 모든 샘플에서 nt는 특이 현상이 나타난다.
경우에 mitotic는 HeLa 세포에서 약한 신호를 가진 ~ 30 nt 제품, RdRP 반응 잘 가지 않 았 어 나타냅니다. 예를 들어 MNase 치료 약 및 부적절 하 게 수행, mitotic 헬러의 신호 강도 세포 감소 크게 (그림 1B). 오래 된 HMD 솔루션 수행 RdRP 반응 또한 제품 (그림 1C)을 줄일 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> 그림 1 : Mitotic는 HeLa 세포에서 내 생 TERT의 대표 RdRP 제품. HeLa 세포에서 IP RdRP 분석 결과의 (A) 3 개의 대표적인 결과 (조작) nocodazole 또는 (unmanipulated) DMSO로 치료. 화학적 합성된 34 nt RNA 템플렛으로 사용 되었다. (B) 부적절 한 MNase 치료 수행 mitotic HeLa 세포에서 IP RdRP 분석 결과. (C) IP RdRP 분석 결과 신선한 또는 오래 된 HMD 솔루션 수행 mitotic HeLa 세포에서. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease, 20 U / µ L</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease 버퍼, 10 배</td>
			<td>8 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td>51 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: MNase 반응 혼합 구성 요소입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>챕 스, 0.07% (wt/권)</td>
			<td>6 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>HMD 솔루션</td>
			<td>2 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 m m</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0.4 m m</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 억제제, 40 U / µ L</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: RdRP 반응 혼합 구성 요소입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 하나 Ribonuclease, 10 U / µ L</td>
			<td>0.2 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>반응 버퍼, 10 배</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td>159.8 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: Ribonuclease 반응 혼합 구성 요소입니다.

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Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

인간의 telomerase 역전사 (TERT) telomeric DNA 뿐만 아니라 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 통해 이중 가닥 RNA 합성. 여기, 내 생 TERT의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 검출 하기 위하여 새로 설립된 된 분석 결과 설명 합니다.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

9.8K 조회수.  National Cancer Center Research Institute. 인간의 telomerase 역전사 (TERT) telomeric DNA 뿐만 아니라 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 통해 이중 가닥 RNA 합성. 여기, 내 생 TERT의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 검출 하기 위하여 새로 설립된 된 분석 결과 설명 합니다.

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

연구

생화학

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

물방울 디지털 트랩 (ddTRAP): Telomere 반복 증폭 프로토콜의 적응은 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 액 적

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

암 연구학

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

환경과학

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

유전학

<meta charset="utf8"></head><body>인간 집단 연구에서 정확한 텔로미어 길이 평가

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 트라우마가 세포 노화에 미치는 영향 탐구

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

Monochrome Multiplex Quantitative PCR 텔로미어 길이 측정 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

Non-Radioactive Chemiluminescence Detection을 사용한 텔로미어 길이 정량화

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

저자 스포트라이트: TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 파라미터 최적화  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 매개변수 최적화

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

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