Name: quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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이 작품에서 교육 과학기술부, 문화, 스포츠, 과학 및 기술의 일본 (KAKENHI) 경호 (#15 K 01691)를, Y.F. (#15 K 08625), 부장 (#26461532), 및의 사역에서 다루기 힘든 질병 프로젝트의 연구에 대 한 부여 연구 보조금에 의해 지원 되었다 건강, 노동 및 복지 (부장 #201510032A) 우리는이 원고 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac) 감사 합니다.

사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 피부에서 파생 된 SM에 의해 샘플 오염을 최소화 하기 위해 장갑을 착용 한다. 현재 프로토콜 2 m m L10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충이 글의 최소 필수 매체에 성장 하는 HeLa 세포에 적용 했다-글루타민 1000 U/L 페니실린, 100 mg/L 스.
1입니다. 지질 샘플의 준비
참고: 모든 유리 시험관 테 플 론 늘어선 나사 모자를 포함 하 여 세제 없이 수 중요 하다.
<ol><li>Bligh 및 염색 방법7 을 사용 하 여 셀 homogenate에서 총 지질 분수의 추출<ol>
<li>문화를 제거 (또는 조건)-10cm 조직 문화 접시와 차가운 PBS의 6 mL로 두 번 린스에서 미디어.</li>
		<li>P1000 피펫으로 여 10 cm 조직 문화 접시에 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 셀 스 크레이 퍼와 세포를 수확 하 고 2.0 mL 시 플라스틱 튜브에 수집 합니다.</li>
		<li>원심 분리 (1000 × g, 5 분, 4 ° C), 후에 상쾌한 P1000 피펫은 제거 합니다.</li>
		<li>메탄올의 1 mL를 추가 합니다. 소용돌이 관 짧게 고 목욕 형 sonicator에 5 분 동안 200 W sonicate. 참고: 셀 펠 릿 효율적으로 무 균 되도록 목욕 형 sonicator의 수 위를 조정 합니다.</li>
		<li>테 플 론 늘어선 나사 모자 테스트 튜브 (13 m m x 100 m m)로 피 펫 메탄올에 셀 homogenate 전송.</li>
		<li>메탄올, 클로 프롬, 두 배 증류수, 0.8 mL 및 50 µ L 10 µ / L 내부 표준 d18:1 /(D31)-16의의 1 mL의 1 mL를 추가: 0 각 시험관에 SM.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 적극적으로 소용돌이 테스트 튜브. 참고:이 시점에서 단일 위상 (클로 프롬/메탄올/물 1/2/0.8 (v/v/v) =) 형성 된다.</li>
		<li>1 mL의 클로 프롬 및 두 배 증류수의 1.0 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 2500 rpm에서 적극적으로 소용돌이 튜브. 참고:이 시점에서,는 수성 (위) 및 유기 (낮은) 위상 구분 됩니다.</li>
		<li>원심 분리 (2150 × g, 5 분, 25 ° C), 후 수집 하 고 일회용 유리 튜브 (초기 낮은 단계)로 낮은 단계를 전송. 참고: 낮은 단계 파스퇴르 피 펫 및 안전 피 펫 필터를 사용 하 여 수집 합니다. 낮은 위상에는 피 펫의 끝을 삽입 하 고 위 위상 및 피 펫, 팁 내부의 계면 보풀을 제공 하는 'E' 밸브 옆 작은 전구를 집어넣은 다음에 피펫으로 낮은 단계를 사이 펀.</li>
		<li>튜브 위 단계와 계면 보풀 충분히 섞어 실 온에서 5 분 동안 2500 rpm에서 적극적으로 테스트 튜브, 그리고 소용돌이에 클로 프롬의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>원심 분리 (2150 × g, 5 분, 25 ° C), 후 수집 하 고 수정 된 낮은 단계 단계 1.1.10에서에서 설명 된 대로 초기 낮은 단계와 일회용 유리 튜브로 전송.</li>
		<li>질소 스트림 아래 유리 튜브를 놓고 완전히 수집된 낮은 단계에서 유기 용 매를 제거 합니다.</li>
		<li>샘플 reconstitute 메탄올 또는 에탄올의 500 µ L, 0.02 µ m 필터, 여과-20 ° c.에 유리 튜브에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>보정 곡선을 건설 하 고 메서드를 유효성 검사를 위한 샘플 준비<ol>
<li>0.1, 0.5, 1, 5, 10, 또는 표준 화합물의 50 µ / L의 50 µ L를 추가 (d18:1 /(D9)-18:1 SM) 테 플 론 늘어선 나사 모자 테스트 튜브로.</li>
		<li>각 시험관에 세포 homogenate를 추가 하 고 1 mL에 메탄올을 추가. 참고: 셀 homogenate 매트릭스로의 양은 각 실험에 따라 다릅니다. 샘플 10 cm 배양 접시에 셀에서 파생 된 SM 종 정기적으로 분석 하 고, 각 테스트 튜브에 세포 homogenate의 양을 10 cm 배양 접시에 셀의 가까이 이어야 한다.</li>
		<li>1.1.6-1.1.14 단계에에서 설명 된 대로 총 지질 분수를 추출 합니다.</li>
		<li>단계 1.2.1-1.2.3에서 descried로 메서드를 유효성 검사에 대 한 품질 검사 (QC) 샘플을 준비 합니다. 표준 화합물의 다른 농도와 3 QC 샘플 준비 (d18:1 /(D9)-18:1 SM): 3 표준 곡선 (QC 로우, QC L), 하나 센터 근처의 더 낮은 경계 배 내에서 (중간 품질 관리, 품질 관리-M)의 상한 근처 하나는 표준 곡선 (QC-높은, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM LC-ESI-MS/MS 분석
<ol><li>모바일 위상의 준비<ol>
<li>혼합 용 제 (이기/메탄올/ddH2O 수성 단계와 소 프로 파 놀 유기 단계에 대 한 2/2/1 (v/v/v) =)에 유리 테 플 론 늘어선 나사 모자 병 및 목욕 형 sonicator에서 5 분 sonicate.</li>
		<li>포 름 산 (최종 농도 26.4 mmol/L)와 NH4오 추가 (14.9 mmol/L) 각 모바일 단계에.</li>
	</ol></li>
	<li>LC-ESI-MS3 SM의 질적 분석<ol>
<li>고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템을 활성화 하 고 모바일 단계를 포함 하는 유리 병에 넣어 입구 튜브 HPLC 라인을 제거. HPLC 시스템에 C18 HPLC 열 (1.5 m m 아이디 × 100 m m 길이, 입자 크기 3.0 µ m)를 연결, 열 오븐에서 50 ° C에 온도 유지 하 고 상태는 autosampl에서 샘플 선반에 샘플을 넣어 100 µ L/분에 수성 모바일 단계와 열 어.</li>
		<li>3 배 4 중 극 및 4 극 자 선형 이온 함정 질량 분석 시스템 MS3 분석 이온의 SM 종의 첫 번째 및 두 번째 전조 뿐만 아니라 표 1 과 표 2 에 나열 된 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>데이터 수집을 위한 소프트웨어 아이콘 더블 클릭, 더블 클릭 ' 하드웨어 구성 ', ' LC + QTRAP4500 + 밸브 ' 선택한 ' 활성화 프로필 '을 클릭 합니다.</li>
			<li>' 새 하위 프로젝트 ' 및 '확인'을 클릭 하 여 새 하위 폴더를 만듭니다.</li>
			<li>'파일' 탭을 클릭 하 고 선택한 '새', ' 수집 방법 ' 및 '확인'을 선택. 10000 Da/s, 극성 '부정적'으로 그리고 '기간' 전체 시간으로 분석 된 (분)으로 속도 스캔, ' MS/MS/MS (MS3)'으로 ' 질량 사양 ' 아이콘 및 스캔 선택 유형 'MS' 탭을 클릭 합니다. 검색 범위는 '시작 (Da)'와 '정지 (다)'의 m/z 를 설정 합니다. SM 종 관심의 대상의 1, 2 선구자 이온의 m/z 를 설정 합니다. 참고: 여러 SM 종 분석, 강조는 '-MS3' 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭, '이 실험 복사' 선택 하 고 다음 다른 SM 종 1, 2 선구자 이온의 m/z 를 넣어.</li>
			<li>' 고급 MS' 탭을 선택 하 고 각 매개 변수를 다음과 같이 설정: '프로 파일', 단계 크기 0.12 (다), 해상도 q 1과 q 3로 스캔 모드 '단위'와 '조명', 각각 50 (ms), 1.5 ms로 대량 범위 사이 일시 중지도 0, 설정 시간으로 강도 임계값 선택 ' 동적 시간을 채우기 ', 8 V, 3 분기 진입 장벽 및 25 ms로 여기 시간.</li>
			<li>'MS' 탭에서 ' 편집 매개 변수 ' 버튼을 클릭 하 고 선택 ' 소스/가스 ' 탭 커튼 가스, 충돌 가스, ionspray 전압, 온도, 이온 소스 gas1 및 gas2 표 1에 나열 된 매개 변수를 설정. 그런 다음 선택 '복합' 탭 declustering 잠재력, 입구 잠재력, 충돌 에너지, 여기 에너지, 및 충돌 에너지는 표 2에 나열 된 전파의 매개 변수 설정.</li>
			<li>' 통합 Valco 밸브 '를 강조 하 고 ' 단계 0에 대 한 위치 이름을 ' a, 선택한 설정 'B' 총에 대 한 위치와 5.0 분 시간. 또한 'A' 총에 대 한 위치 설정 70.0 분 시간.</li>
			<li>'Shimadzu LC 시스템'을 강조 표시 합니다. '펌프' 탭을 선택 하 고 이진 흐름, 0.28 mL/min와 최대 압력 한계 20.0 MPa로 전체 흐름으로 양수 모드를 설정 합니다. 'Autosampler' 탭을 선택 하 고 200 µ L로 헹 구는 볼륨 설정, 35 µ L/s 속도 rinsing, 샘플링 속도 5.0 µ L/s로 52 m m, 스트로크를 바늘, 25.0 분으로 시간을 제거, '전후 포부' 5 s, 그리고 린스 모드 딥 시간을 씻어.<ol>
<li>또한, 쿨러 장치를 활성화, 쿨러 온도 4 ° C로 설정 고 제어 유리병 바늘 선 52 m m. '오븐' 탭을 선택 하는 대로 오븐을 사용 각각 오븐 온도 최고 온도 50 ° C에서 85 ° C로 설정.</li>
				<li>'컨트롤러' 탭을 선택 하 고 확인란을 '에 힘'. ' 시간 프로그램 ' 탭을 선택 하 고 용 매 기울기를 다음과 같이 설정: 용 매 A / 5 분 동안 100/0 비율로 B 80/20을 선형 변경 프로그램 35/65 4 분 이상 50 분 이상 및 25/75 이상 1 분 후 25/75 10 분 동안 다음 선형 100/0에서 그들을 잡고 4 분 이상. 다음 메서드를 사용 하면 저장 합니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>배치 파일 만들기<ol>
<li>' 건설 인수 일괄 ' 아이콘 더블 클릭, 클릭 ' 추가 설정 ', ' 추가 샘플 ', 새로운 샘플 수를 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다.</li>
			<li>' 기가 ' 버튼을 클릭 하 고 사용할 방법을 선택 합니다. 여러 메서드 한 배치 파일에 사용 되는 경우 ' 여러 방법을 사용 '의 상자를 확인 하 고 각 샘플에 대 한 수집 방법을 선택 합니다. ' 샘플 이름 ' 이름 바꾸기 ' 유리병 위치 '에 대 한 적절 한 번호를 설정 하 고 주입 볼륨의 금액을 넣어. 다음 배치 파일을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>LC-ESI-MS3 분석에 의해 MS3 제품의 SM 종의 이온 스펙트럼을 얻기<ol>
<li>배치 파일에서 '제출' 탭을 선택 하 고, 분석 샘플의 줄을 강조 표시 '제출' 버튼을 클릭 합니다.</li>
			<li>클릭은 ' 보기 Quene' 아이콘 '평형' 아이콘을 선택 인수 메서드를 사용할 수 1 분으로 시간을 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다.</li>
			<li>해당 아이콘을 클릭 하 여 ' 튜닝에 대 한 예비 악기 '를 비활성화 합니다. 다음 ' 시작 샘플 ' 아이콘을 클릭 하 여 일괄 처리 시퀀스를 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>질량 이온 스펙트럼 제품의 비 (m/z)를 충전 하 고는 sphingoid의 정확한 질량을 비교 하 여 각 MS3 SM의 제품 이온 스펙트럼 할당 LCB와 N-acyl moiety 관심의. LCB와 N은 sphingoid에서 탄소 이중 수 채권 확인-해당 제품 이온에 따라 acyl moiety.<ol>
<li>적절 한 하위 프로젝트 폴더 선택 되어 있는지 확인, 다음 ' 데이터 파일 열기 ' 아이콘을 두 번 클릭 하 고 샘플 분석을 선택 합니다. SM 종 각 대상에 대 한 크로마에 피크를 끌어서 다음 두 번 클릭 합니다. 드래그 영역 내에서 얻은 MS3 제품 이온 스펙트럼 표시 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>LC-ESI-MS/MS에 의해 SM의 정량 분석<ol>
<li>2.1 및 2.2.1 단계에서 설명한 대로 모바일 단계 및 HPLC 열을 설정 합니다.</li>
		<li>3 배 4 중 극 4 중 극 선형 이온 함정 질량 분석 시스템 모니터링 (MRM) 분석 표 1 과 표 2에 나열 된 여러 반응의 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>2.2.2.1 및 2.2.2.2 단계에서 설명한 대로 절차를 수행 합니다.</li>
			<li>'파일' 탭을 클릭 하 고 선택한 '새', ' 수집 방법 ' 및 '확인'을 선택. 'MRM', '긍정적'으로 극성으로 ' 대량 사양 ' 아이콘 및 스캔 선택 유형 'MS' 탭을 클릭 합니다. 전체 시간 분석을 '기간'을 설정 합니다. [M + H]+ 의 m/z 와 184 ' 1 분기 질량 (Da)'와 ' 3 분기 질량 (다)'의 대상 이자, SM 종으로 각각 설정. 10 ms 및 SM 종 대상의 이름으로 ' ID' '시간'을 설정 합니다.</li>
			<li>' 고급 MS' 탭을 선택 하 고 각 매개 변수를 다음과 같이 설정: 해상도 1 분기의 모두 3 분기 단위로' ', 강도 임계값 0으로 시간 (ms), 0으로 설정 하 고 5 ms로 대량 범위 사이의 일시 중지.</li>
			<li>'MS' 탭에서 ' 편집 매개 변수 ' 버튼을 클릭 하 고 커튼 가스, 충돌 가스, ionspray 전압, 온도, 이온 소스 gas1 및 gas2 표 1에 나열 된 매개 변수를 넣어 ' 소스/가스 ' 탭을 선택 합니다. 잠재력, 입구 잠재력, 충돌 에너지, 그리고 충돌 세포 출구 잠재적인 표 2에 나열 된 declustering의 매개 변수를 넣어 '컴파운드' 탭을 선택 합니다.</li>
			<li>2.2.2.6 단계에서 설명한 대로 밸브를 설정 합니다.</li>
			<li>2.2.2.7 단계에서 설명한 대로 액정 상태를 설정 합니다. 다음 메서드를 사용 하면 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2.2.3 단계에서 설명한 대로 배치 파일을 만듭니다.</li>
		<li>LC-ESI-MS/MS 분석 단계 2.2.4에에서 설명 된 대로 각 SM의 MRM 데이터를 가져옵니다.</li>
		<li>데이터 통합 소프트웨어를 사용 하 여 MRM 데이터를 처리 하 고 SM 종 각의 추출된 이온 크로마 피크 영역 데이터를 가져옵니다.<ol>
<li>정량 분석에서 데이터 통합에 대 한 소프트웨어 아이콘 더블 클릭, '편집' 탭을 클릭 하 고 사용자 통합 기본값을 선택 합니다. 1.0 점으로 가우스 부드러운 너비를 설정 하 고 '확인'을 클릭 합니다. '편집' 탭을 클릭 하 고 ' 새 결과 테이블 '을 선택 합니다. 샘플 통합, 화살표 단추를 누르고 '다음'을 선택 합니다. ' 만들 새로운 방법 '을 선택, 메서드의 이름을 설정 하 고 '다음'을 클릭 합니다. '다음'을 클릭 하 고 d18:1 /(D31)-16의 확인란: 0 그대로 SM '다음'을 클릭 하 고 '마침'을 클릭 합니다.</li>
			<li>'피크 검토 표시'를 클릭 하 고 크로마 봉우리는 적절 하 게 인식 하는 확인 하십시오. 주목 해야 한다 그 d18:1 /(D31)-16의 보존 기간: 0 SM에 의해 일반적으로 작습니다 ~ 34-1 SM 중에 비해 0.3 분 (d18:1 / 16:0 SM에 일반적으로 구성 됩니다).</li>
		</ol>
</li>
		<li>D18:1 /(D31)-16에 SM 종 각의 피크의 비율에 따라 각 SM 종 계량: 0 SM 내부 표준.<ol>
<li>'파일' 탭을 클릭, '내보내기', ' 결과 테이블 ', 'MultiQuant', '모든 열 수출' 열으로 포맷을 확인, '그 명시적으로 숨겨진 제외 하 고 모든 행을 내보내려면', 그리고 '확인'을 클릭 행.</li>
			<li>Excel 소프트웨어에서 내보낸된 파일을 엽니다. IS의 영역 SM 종 대상의 영역을 정상화 (d18:1 /(D31)-16:0 SM). 다음 대상 SM 종 주입 된 샘플에서의 양을 계산 하 주입된 샘플에 IS의 이론적인 금액을 곱하십시오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>표준 곡선을 건설<ol>
<li>D18:1 /(D9)-18의 MRM 데이터: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 단계 2.3.1-2.3.4에 설명 된 대로 LC-ESI-MS/MS 분석 하 여 표준 곡선을 만들기 위한 샘플에 SM.</li>
		<li>D18:1 /(D9)-18의 피크 면적의 데이터: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16:0 SM 2.3.5 단계에서 설명한 대로.</li>
		<li>D18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1에서 설명한 단계 2.3.6으로 주입 된 샘플에서 SM.</li>
		<li>/(D9)-18 명목 금액 및 d18:1의 계산 된 금액으로 x 축과 y 축을 설정 하 여 추세선을 구성: 1 SM 추세선 수식의 얻을.</li>
	</ol></li>
	<li>양적 방법 Excel 소프트웨어를 사용 하 여 유효성 검사<ol>
<li>방법의 유효성 검사에 대 한 d18:1 /(D9)-18의 양을 계량: 1 SM 및 d18:1 /(D31)-16: 0는 QC에 SM 샘플링 각 QC를 분석 하 여 1 일에 세 번 이상 샘플 및 단계 2.3.1-2.3.4에 설명 된 대로 최소 3 일을 반복.</li>
		<li>피크 지역 데이터를 가져오고 d18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1에서 설명한 단계 2.3.5 2.3.6으로 삽입 된 샘플에 SM.</li>
		<li>얻은 보정 곡선에 따라 d18:1 /(D9)-18의 양을 계산: 1 삽입 된 샘플에서 SM.</li>
		<li>정밀 평가<ol>
<li>평균 및 표준 편차 d18:1 /(D9)-18의 금액의 계산: 1 SM 2.5.3-하루의 데이터 집합에 단계에서 얻은 및 Excel 소프트웨어를 사용 하 여 간 일.</li>
			<li>2.5.4.1 단계에서 얻은 평균 표준 편차로 나눈 값 이며, %로 표시.</li>
		</ol>
</li>
		<li>정확도의 평가<ol>
<li>다음과 같이 각 데이터의 정확도 계산. [(계산된 양 단계 2.5.3에서에서 얻은입니다.) / (명목 금액)-1] × 100(%)</li>
			<li>하루 간 날의 dataset에 정확도의 절대 값의 평균을 계산 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases.">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li><li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery.">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li><li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+degradation+pathways,+functions,+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides.">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li><li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipidomics:+high-throughput,+structure-specific,+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li><li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3.">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li><li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin.">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li><li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS/MS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability,+data+quality,+and+assay+performance.">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+dissociation:+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions.">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li><li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry.">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li><li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry.">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li><li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry.">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li></ol>

저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.

현재 질적 방법에서 우리가 MS3 는 SPC와 N의 제품 이온을 얻은-acyl moiety. 제대로 SPC와 N을 할당 하는 것이 중요-acyl moiety. 이 위해, 그것은 다른 phosphorylcholine 포함 된 분자 또한 MS3 제품 이온으로 검출 될 수 있습니다 주목 해야한다. Diacyl-phosphatidylcholine (PC)와 plasmalogen-PC는 포유류 세포에 풍부 하 게 존재 이며 그들의 hydrophobicity SM 비슷합니다. 따라서, diacyl-PC와 동위 원소...

Sphingomyelin (SM)은 포유류 세포에 있는 일반적인 sphingolipid. SM은 합성 침1 와 다른 sphingolipids에 대 한 선구자로 서 현재와 같은 면역에 중요 한 역할을가지고 있는 sphingosine 1 인산 염 및 세 라마 이드, 밀매 셀 피부 장벽 항상성, 각각2, 3. 따라서, SM 대사의 정확한 분석 elucidating sphingolipids의 생리 및 병 적인 역할에 대 한 중요 하다.
SM는 세 라마 이드와는 sphingosine와 N의 추가 구성 되는 세 라마 이드의 1 hydroxy 그룹에 연결 되는 phosphorylcholine의 구성-acyl moiety. Sphingosine N에 탄소와 이중 결합의 숫자에 다양 한-acyl moiety 세 라마 이드 (SM)의 수 종에서 결과. LC-ESI-MS/MS의 최근 발전은 SM4,5의 양적 및 질적 분석을 활성화 하 고. 질적 분석, 탄소 수와 sphingoid LCB의 SM의 이중 결합 LCB의 제품 이온 스펙트럼을 할당 하 여 확인 되었습니다. 그러나, N의 구조 정보-acyl moiety는 직접 얻지 못하면는 해당 제품 이온 보고 하지 않은, 때문에 그리고 그러므로 N-acyl moieties 선구자 이온 사이 차동 분석 추론 했다 고 제품 이온 모두 긍정적이 고 부정적인 이온 모드4,5에 LCB에 해당. 이 보고서에서는 LCB와 N의 제품 이온을 검출 하는 방법 소개-acyl moiety 트리플 4 중 극 4 중 극 선형 이온 함정 질량 분석, 정확한 구조를 용이 하 게 하를 사용 하 여 MS3 모드에서 동시에 각 SM 종6의 추측
생물 학적 샘플 매트릭스로 인 한 이온 억제 (또는 강화) 효과 방해 LC-ESI-MS 분석, 정확한 정량화 하 고 따라서, 그것은 동일한 매트릭스에 대 한 관심의 모든 analytes에 대 한 교정 곡선을 생성 하는 것이 좋습니다. 생물 학적 샘플. 그러나,이 전략은 불가능 하기 때문에 그것은 거의 모든 SM 종 종합 분석에 특히 생물학 견본에서 준비 가능 하지. 따라서, 보정 곡선을 건설 하 고 대표적인 SM 종 생물 학적 샘플에서 아군을 사용 하 여 양적 범위를 결정 하는. 우리는 보정 곡선; 구성 두 isotopically 표시 된 SM 종 사용 하나는 내부 표준 및 표준 화합물에 대 한 다른 사용 되었다. 우리는 생물 학적 샘플에 아군 하 고 성공적으로 교정 곡선과 양적 범위6표준 화합물으로 SM 종 isotopically 표시의 작은 금액을 감지.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm tissue culture dish</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized 2.0 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Test tube</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-lined screw cap</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Disposable glass tube</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &amp;micro;m 1.5 mm I.D. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge holder</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropyl Alcohol)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% Ammonia water</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (bath type)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer for glass test tube</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4 mL glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>8 mm septum</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum</td></tr><tr><td>Screw cap for 1.4 mm glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap with slit septum</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>The software for data acquisition and analysis of product ion spectra</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>The software for data integration in quantitative analysis</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC system</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sphingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosylphosphorylcholine</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;rsquo;s minimum essential medium</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species

우리는 방법 sphingomyelin (SM) 질적 분석의 양적 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (LC-ESI-MS/MS)에 의해 제시. SM은 일반적인 sphingolipid는 phosphorylcholine와는 세 라마 이드의 친수성 및 소수 성 구성 요소로 각각 구성. SM 종 수 sphingoid 긴 체인 베이스 (LCB) 다양 한 때문에 포유류 세포에 존재 하는 N-acyl moiety는 세 라마 이드에. 이 보고서에서는 탄소와는 LCB와 N이중 결합의 수를 추정 하는 방법을 보여 줍니다-acyl moiety MS/MS/MS (MS3) 실험에서 그들의 해당 제품 이온에 따라. 또한, 우리는 현재 정량 분석 방법 에스엠에 대 한 종을 사용 하 여 두 개의 안정적인 isotopically 레이블 SM, SM 정량에 사용 되는 범위를 결정을 용이 하 게 하. 현재 메서드는 SM 종 생물 학적 샘플 및 화장품 등 산업 제품의 다양 한 특성화에 유용할 것 이다.

화학적 합성 d18:1 / 24:0 SM (그림 1A)와 d18:1 / 24:0 SM HeLa 세포 (그림 1B)에서 추출한 지질 샘플에서 LC-ESI-MS3 채용 [M + HCOO]- , [M-채널3]에 의해 분석 되었다- 첫 번째 및 두 번째 선구자 이온으로 각각. Demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449)의 스펙트럼 강도 SM N...

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Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

여기, 우리가 현재 계량 하 여 여러 반응 모니터링을 사용 하 여 각 sphingomyelin 종 자격 프로토콜 및 MS/MS/MS 모드, 각각.

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K 조회수.  Teikyo University. 여기, 우리가 현재 계량 하 여 여러 반응 모니터링을 사용 하 여 각 sphingomyelin 종 자격 프로토콜 및 MS/MS/MS 모드, 각각.

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

연구

생체공학

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

생화학

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 LC-MS 분석

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

환경과학

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

화학

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Glycosphingolipid 항원의 대량 Spectrometric 분석

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

면역학 및 감염병학

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether sphingolipids are altered in a disease and investigate whether sphingolipids can be targeted clinically. However, properly powered prospective studies that acquire tissues directly from the surgical suite can be time consuming, and technically, logistically, and administratively challenging. In contrast, retrospective studies can take advantage of cryopreserved human specimens already available, usually in large numbers, at tissue biorepositories. Other advantages of procuring tissues from biorepositories include access to information associated with the tissue specimens including histology, pathology, and in some instances clinicopathological variables, all of which can be used to examine correlations with lipidomics data. However, technical limitations related to the incompatibility of optimal cutting temperature compound (OCT) used in the cryopreservation and mass spectrometry is a technical barrier for the analysis of lipids. However, we have previously shown that OCT can be easily removed from human biorepository specimens through cycles of washes and centrifugation without altering their sphingolipid content. We have also previously established that sphingolipids in human tissues cryopreserved in OCT are stable for up to 16 years. In this report, we outline the steps and workflow to analyze sphingolipids in human tissue specimens that are embedded in OCT, including washing tissues, weighing tissues for data normalization, the extraction of lipids, preparation of samples for analysis by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS), mass spectrometry data integration, data normalization, and data analysis.

Sphingolipids are bioactive metabolites with well-established roles in human disease. Characterizing alterations in tissues with mass-spectrometry can reveal roles in disease etiology or identify therapeutic targets. However, the OCT-compound used for cryopreservation in biorepositories interferes with mass-spectrometry. We outline methods to analyze sphingolipids in human tissues embedded in OCT with LC-ESI-MS/MS.

질량분석 분석을 위한 최적의 절단 온도 화합물에 내장된 인체 조직의 준비

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

암 연구학

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

생물학

안정 동위원소 라벨링을 사용한 지질 구조 스크리닝

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

저자 스포트라이트: Quantification of Complex Lipidomic Samples Using Stable Isotope Labeling (안정 동위원소 라벨링을 사용한 복잡한 지질도미 시료의 정량화)

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

안정 동위원소 라벨링 LC-TIMS-TOF MS/MS를 사용한 새로운 지질 추적

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

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