이 작품은 PTR에 건강의 국가 학회 (R01-NS084941)와 애리조나 생물 의학 연구 위원회 (ADHS16-162406)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. WA는 과거의 국가 연구소의 건강 교육 부여 (T32-HL007249)을 미리 박사 약속에서 지원 받았다.

아래에 설명 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다와 국립 보건원 (NIH) 및 동물 연구: Vivo에서 실험 (도착) 지침을 보고. 프로토콜에 대 한 절차 흐름은 그림 1에 묘사 된다.
1입니다. 설정 절차에 대 한
<ol><li>뇌 microvessel 버퍼 (BMB)를 준비 합니다. 54.66 g D-마 니 톨, 1.90 g EGTA, 깨끗 한 비 커에 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (즉, 트리 스) 자료를 재 시작 합니다. 이온된 수의 1.0 L를 추가 합니다. 자력 교 반기를 사용 하 여 BMB 버퍼의 구성 요소를 믹스. 일단 솔루션을 철저 하 게 혼합 되어, pH 7.4 1.0 M HCl을 사용 하 여를 조정 합니다.</li>
	<li>동물을 마비 전에 26 %dextran (MW 75000) 솔루션 (w/v)을 준비 합니다. 다음 단계에 설명 된 대로 dextran 솔루션을 준비 합니다. 참고: 그것은 비판적으로 dextran 약 1.5-2 h 수성 버퍼에 분해를 걸릴 수 있기 때문에 미리이 솔루션을 준비 하는 것이 중요.<ol>
<li>깨끗 한 비 커에 가루 dextran (26 g 버퍼 100 mL 당) 밖으로 무게.</li>
		<li>BMB의 적절 한 양을 밖으로 측정 하 고, 깨끗 한 별도 비 커에 분배.</li>
		<li>천천히 BMB 붓고 가루 dextran을 포함 하는 비 커. 수동으로 BMB 유리 저 어 막대를 사용 하 여의 붓는 동안 가루 dextran을 믹스.</li>
		<li>사용 하 여 즉시 사전 1.0 M HCl와 7.4에 pH를 조정 합니다. 참고: 12 개별 Sprague-Dawley 쥐에서 뇌 microvessels의 일반적인 격리 (남성 또는 여성; 나이의 3 개월, 200-250 g) dextran 솔루션 (즉, 52 g dextran BMB의 200 ml에서) 200 mL를 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sprague-Dawley 쥐에서 뇌 조직 추출
<ol><li>케 타 민 (50 mg/kg, 2.5 mL/kg i.p.) 및 xylazine를 사용 하 여 Sprague-Dawley 쥐 anesthetize 다음과 같은 원하는 실험 치료 (10mg/mL; 2.5 mL/kg 나, p.). 마 취 제와 최종 농도 20 mg/mL 및 4.0 mg/mL의 0.9% 염 분에서 xylazine을 각각 희석. 잘린 IACUC 지침에 따라 날카롭게 단두대를 사용 하 여 동물을 안락사. 동일한 절차를 사용 하 여 둘 다 남성과 여성 Sprague-Dawley 쥐를 위해.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 단일 가로 컷 하 여 쥐 두개골에서 피부를 resect.</li>
	<li>Rongeurs를 사용 하 여 신중 하 게 두개골 플레이트를 제거 하 고 뇌를 노출.</li>
	<li>주걱을 사용 하 여 뇌를 제거 합니다. 뇌를 분리 고 격리 된 뇌 조직 50 mL 원뿔 튜브 BMB의 5 mL를 포함 합니다. 프로 테아 제 억제 물 사용 전에 즉시 BMB 버퍼의 1.0 mL 당 칵테일의 1.0 μ를 추가 합니다.</li>
</ol>3. 두뇌 처리
<ol><li>50 mL 원뿔 튜브의 뇌 조직 깨끗 한 페 트리 접시에 전송.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 부드럽게 롤 두뇌에 대뇌 피 질에 느슨하게 준수 외부 meninges 제거 하 12.5 cm 직경 필터 종이. 부드럽게 필터 종이 대 한 뇌 조직의 누르고 다시 조직 롤. 이 단계 동안 자주 필터 종이 켜십시오.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 대뇌 반구에서 맥락 막 신경 총을 구분 합니다. 참고: 맥락 막 신경 총 대뇌 뇌 실의 표면에 지역화 된 맑은 액체로 조직으로 나타납니다.</li>
	<li>부드럽게 뇌 조직의 평평 하 고 나머지 meninges과 후 각 전구 집게를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>장소 냉장된 유리 박격포로 대뇌 피 질의 뇌 조직. 박격포를 BMB 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 5.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>오버 헤드 전원 균질 화기를 사용 하 여, 3700 rpm에 선 위아래로 15를 사용 하 여 뇌 조직의 균질. 균질 10 mL 박격포와 유 봉 조직 분쇄기를 사용 하 여 수행 합니다. 각 개별 샘플의 균질, 사이 유 봉 70% 에탄올을 사용 하 여 청소. 참고: 균질 선 속도 관점에서 일관 되 고 크기.</li>
	<li>레이블이 지정 된 원심 분리기 튜브에는 homogenate를 부 어.</li>
</ol>4. 원심 분리 단계
<ol><li>뇌 homogenate 포함 된 각 레이블이 원심 분리기 튜브를 26 %dextran 솔루션 8.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>튜브를 두 번 반전 그리고 철저 하 게 소용돌이 샘플. 뇌 26 %dextran 솔루션 homogenate 솔루션의 철저 하 게 혼합 되도록 여러 각도 사용 하 여 각 샘플의 vortexing를 실시 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기 샘플 참고: 일부 분석에 대 한 그것은 뇌 microvessels 뇌 실질과 비교 하는 데 유용입니다. 뇌 실질에 단백질 식의 평가 해야 필요한이 원심 분리 단계 (즉, 뇌 parenchymal 분수)에서 상쾌한 수집 고 나중에 사용-80 ° C에 저장.</li>
	<li>진공 흡 인기를 사용 하 여 상쾌한을 제거 하 고 유리 파스퇴르 피 펫. 참고: 주의 펠 렛을 방해 하지로 이동 해야 합니다. 그렇지 않으면, 뇌 microvessels 수집의 수량이 줄어들 것입니다는이 절차에서 단백질 수확량 크게 줄어.</li>
	<li>BMB 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (즉, 1.0 μ 프로 테아 제 억제 물 칵테일 BMB 버퍼의 1.0 mL 당)의 5.0 mL에 펠 릿을 resuspend. 철저 하 게 혼합 되도록 펠 릿 소용돌이입니다.</li>
	<li>각 원심 분리기 튜브와 소용돌이 4.1-4.2이이 프로토콜의 단계에서 설명한 대로 26 %dextran 8.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기 샘플</li>
	<li>진공 플라스 크, 유리 피 펫을 사용 하, 상쾌한 발음 하 고 뇌 microvessel를 포함 하는 펠 릿 방해 하지 확인 하십시오. 참고: 초과 소재 튜브 벽에 고착 했다 microvessels를 포함 하지 않는 해야 될 신중 하 게 청소 하 고 제거.</li>
	<li>두 번 추가는 4.8-4.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>일단 4 dextran 원심 분리 단계 완료 되었습니다, 그리고 각 펠 릿 및 resuspend 샘플을 소용돌이 BMB의 5.0 mL를 추가 합니다. 참고: 다음 단계 4.10의 완료, 전체 microvessels 단백질 지 방화의 분석에 대 한 수집할 수 있습니다. 이 여 50 μ 다시 중단된 microvessel 펠 릿의 aliquot 유리 현미경 슬라이드에 번짐 수행할 수 있습니다. Microvessels는 뒤에 얼음 처럼 차가운 에탄올에 고정 추가 10 분 슬라이드 이미징 연구에 필요한 때까지 4 ° C에 저장 된 다음 수 열 블록에 10 분 동안 95 ° C에서 열 고정.</li>
</ol>5. Ultracentrifugation 총 뇌 Microvascular 막의 샘플을 준비 하
<ol><li>냉장된 유리 균질 화기에 샘플을 전송.</li>
	<li>오버 헤드 전원 균질 화기를 사용 하 여 3000 rpm에서 선 위아래로 8-10을 사용 하 여 뇌 조직의 균질. 균질 10 mL 박격포와 유 봉 조직 분쇄기를 사용 하 여 수행 됩니다. 유 봉 각 개별 샘플의 균질에 따라 70% 에탄올을 사용 하 여 청소.</li>
	<li>Ultracentrifuge 튜브를 청소 하는 샘플을 전송 합니다. 번호와 각 개별 튜브 무게. 균형 그리고 ultracentrifuge로 터에 로드 하기 전에 튜브 쌍. 참고: 모든 무게와 ultracentrifuge 튜브의 해야 합니다 실시는 모자에 튜브 무게의 정확한 측정을 보장 하기 위해.</li>
	<li>4 ° c.에서 1 h 150000 x g 에서 원심 분리기 샘플</li>
	<li>상쾌한 발음 진공 플라스 크, 유리 피 펫 파스퇴르를 사용 하 여 모 세관 멤브레인 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 사용 하 여.</li>
	<li>펠 릿 크기에 따라 달라 집니다, 1:1 (v/v) 비율로 이온된 수와 BMB의 구성 된 저장소 버퍼의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 일반적으로 펠 릿 저장 버퍼의 400-500 μ에 resuspended 있다. 프로 테아 제 억제 물 칵테일 저장소 버퍼의 1.0 mL 당 1.0 μ의 비율에서 저장소 버퍼에 추가 합니다.</li>
	<li>펠 릿 저장 버퍼에 resuspend를 소용돌이 샘플.</li>
	<li>Using 유리 파스퇴르 피 펫, 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 관에 모 세관 막 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>바늘을 통해 패스 샘플 샘플은 철저 하 게 혼합 하 고 아무 셀룰러 집계 존재 5 x 주사기.</li>
	<li>-80 ° c까지 분석에 필요한 샘플을 저장 합니다. 참고: 각 microvessel 막 샘플의 단백질 콘텐츠 브래드포드 메서드를 사용 하 여 측정 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li><li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection:+Relevance+to+Treatment+of+Stroke.">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).</li><li>Ronaldson, P. T., Davis, T. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain:+a+role+for+P-glycoprotein.">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li><li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+pain+signals+an+increase+in+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier.">Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier.</a> J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).</li><li>Pop, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+brain+injury+alters+the+blood-brain+barrier+phenotype+in+parallel+with+beta-amyloid+and+cognitive+changes+in+adulthood.">Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).</li><li>Thompson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+(Oatp1a4)+at+the+blood-brain+barrier:+relevance+to+CNS+drug+delivery.">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li><li>Tome, M. 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P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor.">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li><li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. 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M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li><li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo.">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li><li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences.">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li><li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+(Mrp1)+in+glial+cells.">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li><li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran.">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. 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이 문서에서는 갓 쥐 뇌 조직에서 분리 된 microvessels에서 막 단백질 샘플 준비의 간단 하 고 효과적인 방법을 설명 합니다. 격리 된 microvasculature에서 쥐 뇌 microvessels의 격리 및 막 준비의 세대에 대 한 몇 가지 방법은 문학13,20,,2122 에 보고 되었습니다. , 24.이 이렇게 하나의 실...

혈액-뇌 장벽 (BBB) 중앙 신경 시스템 (CNS)와 조직의 순환 간의 인터페이스에 존재 하 고 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할. 구체적으로, 정확 하 게 제어 용 질 농도에 효율적으로 뇌 조직 CNS1의 상당한 변화 요구를 충족 하는 데 필요한는 그 영양분을 공급 하 고 뇌 세포 외 액에는 BBB 기능. 이러한 역할 의미 microvascular 내 피 세포의 수준에 있는 BBB 잠재적으로 유해한 xenobiotics 수 없습니다 하면서 뇌 실질에 액세스 하는 일부 물질을 사용할 수 있는 개별 메커니즘을가지고 있어야 합니다. 축적. 사실, microvascular 내 피 세포 fenestrated 하지 않습니다 하 고 비 선택적인 침투성2의 부족을 보장 제한 pinocytosis 전시. 또한, microvessel 내 피 세포 꽉 접점과 외화 접합 단백질 형태로 실제 인접 한 내 피 세포 사이의 "봉인"과 뇌에 혈액을 매개로 물질의 paracellular 확산을 크게 제한 하는 표현 실질입니다. 사실, 내 인 성 및 외 인 성 물질의 선택적인 침투성의 통풍 관 및 경과 전송기3기능 식이 필요합니다. 전반적으로, 단단한 접속점, 외화 교차점, 및 전송기는 BBB의 독특한 장벽 속성을 유지 하기 위해 콘서트에서 작동.
BBB는 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽이 다. 예를 들어 산소/reoxygenation 스트레스는 혈관 마커 등을 증가 paracellular 침투성와 관련 중요 한 꽉 접합 단백질 (즉, occludin, zonulae occluden-1 (조로-1))의 식을 조절 하 보였다 자당4,,56으로. 외상 성 뇌 부상7 설정 주변 염증 성 통증8,9에서 BBB에서 비슷한 관찰 되었습니다. 이 같은 질병 또한 BBB10,,1112,13,14에서 전송 메커니즘을 조절 수 있습니다. 실제로, 저 산소 증/reoxygenation 부상 향상 polypeptide 1a4 수송 유기 음이온의 기능 식 (Oatp1a4)에서 BBB,으로 이어질 수 있는 특정 Oatp 전송 기판의 혈액-뇌 전송에 상당한 증가 같은 taurocholate 및 틴이13. BBB 속성 pharmacotherapy 자체, 뇌에 약물 효과에 모두 깊은 변화 및 약물-약물 상호 작용에 대 한 기초를 형성 수 있습니다 메커니즘에 의해 변경할 수 있습니다. 예를 들어 뇌 microvascular 내 피 세포에 아 세트 아미노 펜 대상 핵 수용 체 신호 메커니즘 기능 표현의 중요 한 경과 전송 P-당단백질 (P-gp), 증가 하 고 수정 하는 시간에 따른 진통 모 르 핀에 의해 수 여 된 opioid 진통제 약물 설립된 P-gp 수송 기판15. BBB 변화, 질병 또는 약물에 의해 유도 될 수 있다, 그의 철저 한 이해는 또한 식별 및 이러한 수정을 제어 하는 특정 규제 메커니즘의 필요 합니다. 사실, 이산 신호 경로 꽉 접합 단백질16,17 및 전송기15, 의 분자 표현 제어 하는 두뇌 microvascular 내 피 세포에서 발견 되었습니다 18,19. 함께 찍은, 이러한 관측 복잡 한 분자 경로 BBB 꽉 접합의 규제와 건강 및 질병에 전송기에 관련 된 나타냅니다.
BBB의 연구에 중요 한 도전 막 샘플의 후속 준비 및 실험 동물에서 파생 된 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법의 절대적인 요구 사항입니다. 이 샘플은 모두 뇌 microvascular 내 피 세포에 농축 하 고 다른 세포 유형의 존재에 제한 준비 되어야 한다. 지난 몇 년 동안 설치류 두뇌에서 microvasculature의 격리에 대 한 여러 방법론 과학 문학13,20,,2122에 보고 되었습니다. 이 문서에서는 간단 하 고, 강력한, 및 쥐 두뇌에서 microvessels의 격리 및 단백질 발현의 분석에 사용할 수 있는 내 피 막 농축 샘플의 준비에 대 한 재현 방법. 이 microvessel 격리 프로토콜의 한 장점은 개별 실험 동물에서 충분 한 단백질 수율과 높은 품질의 샘플 준비를 얻을 수 있습니다. 단백질 표정에 간 동물 다양성의 고려 수 있습니다. BBB에서 단백질 변경의 진정한 크기의 과대평가 (또는-추정) 수 이제 피할 수 있기 때문에이 프로토콜에는 이러한 사전은 크게 BBB 연구의 견고성을 향상. 또한, 여러 원심 분리 단계 dextran 포함 뉴런 등 원치 않는 세포 성분의 제거를 촉진 하는 동안 실험 샘플에서 microvessels의 향상 된 농축 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Dextran (MW 75,000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma</td></tr><tr><td>Zetamine</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>0.9% saline solution</td><td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>General anesthetic diluent</td></tr><tr><td>Filter Paper (12.5 cm diameter)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>Used for removal of meninges from brain tissue</td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>Disposable tubes used for dextran centrifugation steps</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Coomassie Plus (Bradford) Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Measurement of protein concentration in membrane preparations</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#358039</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Required for pH adjustment of buffers</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Protein standard for Bradford Assay</td></tr><tr><td>Standard Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#91100-12</td><td>Used for dissection of brain tissue</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>#16020-14</td><td>Used for opening skull to isolate brain</td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>Used for collection of brain tissue following isolation</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>Used for aspiration of cellular debris following dextran spins</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>Used for ultracentrifugation of samples</td></tr></tbody></table>

a simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels

혈액-뇌 장벽 (BBB)은 다양 한 병 태 생리 및 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽 조직. 이러한 자극 으로부터 발생 하는 이러한 변경 고 수 있습니다 크게 뇌에 약물 전달 조절, 확장 하 여, 질병의 원인이 상당한 도전 중앙 신경 치료에서 (CNS). Pharmacotherapy에 영향을 주는 많은 BBB 변화를는 지역화 된 내 피 세포의 수준에서 단백질을 포함 한다. 실제로, 건강 및 질병에 BBB 생리학에 이러한 지식은이 막 단백질의 연구에 상당한 관심을 촉발 했다. 기초 과학 연구의 관점에서이 실험 동물에서 수확 하는 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하지만 강력 하 고 재현할 수 방법에 대 한 요구를 의미 합니다. 갓 격리 된 microvessels에서 막 샘플을 준비 하기 위하여 샘플 준비 내 피 세포에 농축 되어야 하지만 다른 세포 유형 (즉, 이다, microglia, 신경, 혈관 단위의 존재 제한 필수적 이다 pericytes)입니다. 추가 혜택 개별 동물에서 실험적인 인구에서 단백질 식의 진정한 변화를 캡처하기 위해 샘플을 준비 하는 기능입니다. 이 원고에서 쥐 뇌 microvessels의 고립과 막 샘플의 준비에 대 한 활용 방법에 관한 세부 정보는 제공 됩니다. Microvessel 농축, 파생, 샘플에서 dextran 샘플 버퍼에 포함 된 4 개의 원심 분리 단계를 사용 하 여 이루어집니다. 이 프로토콜은 그들의 자신의 특정 응용 프로그램에 대 한 다른 실험실에 의해 쉽게 적응 수 있습니다. 이 프로토콜에서 생성 된 샘플 크게 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극 응답 BBB의 이해를 원조 할 수 있는 단백질 분석 실험에서 강력한 실험 데이터를 얻을를 보였다.

쥐 뇌 microvessels의 격리 및 microvessel 막 샘플의 준비에 대 한 실험 흐름은 그림 1에 표시 됩니다. 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 쥐 두뇌에서 그대로 microvessels의 성공적인 절연 설명 된다 (그림 2A). 이러한 혈관 원심 dextran와 ultracentrifugation 막 샘플 (즉, 다음 준공 단계 4.10) 준비를 개시 직전의 완료 후 얻은 했다. 이 이미지는 m...

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A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.

신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

a-simple-reproducible-method-to-prepare-membrane-samples-from-freshly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K 조회수.  University of Arizona, Tucson. 여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

연구

의학

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

신경과학

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

신경 말단에서 시 냅 스 소포 분포의 미세 구조 형태학 적 분석을 위한 신생아 쥐 뇌 조직의 제조

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

생물학

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

마우스에서 대뇌 골후혈구를 분리하는 고출력 방법

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

Source: Molino, Y. et al. <a href="https://www.jove.com/v/51278/setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb">Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2014)
This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

쥐 뇌 미세혈관에서 내피 세포 배양: 쥐 뇌의 미세혈관에서 내피 세포를 분리 및 배양하는 절차

Source: Molino, Y. et al. Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구학

Cancers of the Nervous System

In vitro studies

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free 배지를 이용한 쥐 뇌로부터의 미세아교세포(Microglia)

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

Source: Boulay, A. C. et al. <a href="https://www.jove.com/video/53208" target="_blank">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse&#39;s brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

쥐 뇌 혈관 분리: 쥐 뇌 샘플에서 온전한 혈관을 분리하는 프로토콜

Source: Boulay, A. C. et al. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a ...

In vivo studies

Obtaining a Single-Cell Suspension from Frozen Rat Brain Tissue

Source: Rubio, F. J., et. al. <a href="https://app.jove.com/v/54358">Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the dissociation of frozen rat brain tissue into a single-cell suspension using enzymatic digestion and mechanical trituration. The prepared cells are fixed and permeabilized with ethanol for downstream applications like flow cytometry or gene expression analysis.

Source: Rubio, F. J., et. al. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat ...