이 방법은 CRISPR 촉진 실험을 위한 가이드 RNA 발현 플라스미드의 생성을 용이하게 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복제가 단일 단계에서 수행될 수 있고 쌍가이드 RNA가 단일 가이드 RNA 발현 플라스미드를 사용하여 생성될 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜을 시작하려면 1X TE 버퍼에서 100 마이크로몰러의 최종 농도로 리오필화된 프라이머를 희석시다.
Aliquot는 PCR 스트립 캡 튜브에 동일한 양의 전방 및 역 프라이머를 넣습니다. 혼합 소용돌이. 다음으로, 15초 동안 100배 G에서 가이드 RNA 올리고뉴클레오티드 혼합물을 회전시한다.
결찰을 설정하기 전에 실온에서 5 분 동안 반응을 배양합니다. 선택한 PSB700 가이드 발현 벡터의 1~5마이크로그램을 벡터 1마이크로그램당 BSNB1의 0.5 마이크로리터를 사용하여 BSNB1에 추가합니다. 총 부피가 40 마이크로리터가 될 때까지 증류수를 추가하고 섭씨 55도에서 1시간 동안 소화를 수행합니다.
1.5% 낮은 녹는 아가로즈 젤에 소화 제품을 실행합니다. 크기약 9킬로베이스에 해당하는 소화벡터 백본 밴드를 잘라냅니다. 이 젤 슬라이스를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
상용 젤 정화 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 아가로즈 젤에서 DNA를 추출하십시오. 그런 다음 DNA를 TE 버퍼의 10-15 마이크로리터로 희석하여 농축 된 엘루트를 얻습니다. 결찰을 수행할 준비가 되면 유리병에 증류수 15마이크로리터를 추가합니다.
이전에 아닐 가이드 RNA 올리고뉴클레오티드의 마이크로리터 1개, BSNB1 소화 PSB700 가이드 발현 벡터의 마이크로리터 1개, 10XT4 DNA 리개서 반응 버퍼2마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 이 솔루션을 소용돌이로 섞습니다. DNA 리구아제와 소용돌이의 마이크로리터 1개를 다시 추가합니다.
15초 동안 100배 G로 솔루션을 회전시합니다. 밤새 실온에서 반응을 배양하여 BSNB1 소화 벡터를 단독으로 포함하는 삽입 음성 제어 반응을 포함시키는 데 있어 RNA 올리고테 삽입을 삽입한다. 먼저 E.coli를 영하 80도의 저장에서 제거하고 얼음 위에서 5~10분 동안 해동하십시오.
유능한 대장균의 8 마이크로 리터에 준비 된 반응 혼합물의 0.5 마이크로 리터를 추가합니다. 혼합물을 얼음에 30분 간 보관하십시오. 45초 동안 섭씨 42도에서 혼합물을 열충격.
그런 다음 혼합물을 얼음 위에 2 분 동안 놓습니다. 로터리 셰이커를 사용하여 NEB DH5a 또는 NEB 마구간에 나열된 조건을 사용하여 SOC 미디어의 250 마이크로리터에서 문화를 회복하십시오. 그 후, 적절한 항생제 내성 리소겐국물 판에 배양의 80 마이크로리터를 플레이트.
NEB DH5a의 경우 섭씨 37도 또는 NEB 마구간의 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 먼저 푸시온 GC 특수 PCR 프로토콜을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 조각을 만듭니다. 이 PCR 제품을 1% 아가로즈 젤로 실행하고 약 490개의 베이스 쌍에서 한 밴드가 보이는지 확인합니다.
젤 추출 키트를 사용하여 이 PCR 제품을 잘라 추출하십시오. 그런 다음 준비된 1X 마스터 믹스를 PCR 튜브로 알리쿼트합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 마이크로리터 당 40 펨토몰농도로 PCR 제품의 마이크로리터 1개를 추가합니다.
PSB700 벡터의 한 마이크로리터에서 마이크로리터 당 40 펨토몰농도를 추가합니다. 가이드 RNA 올리고뉴클레오티드 대신 1개의 마이크로리터를 사용하여 인서식 제어를 포함하지 않는다. 텍스트 프로토콜에 설명된 Golden Gate 프로토콜을 사용하여 벡터를 소화하고 한 반응에서 삽입을 리게이트합니다.
초기 황금 문 반응 후 각 반응에 BSNB1 효소의 추가 0.5 마이크로 리터를 추가합니다. 1 시간 동안 섭씨 55도에서 반응을 계속하십시오. 황금 문 반응이 완료되면 이전에 설명된 대장균 변환 과정으로 진행한다.
이 연구에서는, 단일 가이드 RNA 발현 벡터는 두 가지 방법을 사용하여 성공적으로 생성된다. 첫 번째 방법에서, 벡터 백본은 일련의 짧은 올리고뉴클레오티드에서 미리 소화되고 리게된다. 두 번째 방법은 황금 문 복제를 사용하여 동시에 단일 반응으로 소화하고 리게이트했습니다.
쌍가이드 RNA 발현 벡터는 각각 자체 독립 프로모터에 의해 구동되며 사용자 지정 PCR 단편을 복제하여 성공적으로 생성됩니다. 이러한 방법 중 하나에 대한 성공적인 복제는 삽입 제어 플레이트에 비해 적절한 삽입 DNA로 변환을 위해 훨씬 더 많은 식민지의 출현을 초래할 것이다. 이 절차를 시도하는 동안 복제 단계에 삽입 컨트롤을 포함하지 않는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 후성 유전체 공학 같은 다른 방법은 크로마틴 서명유전자 발현에 어떤 효과 같은 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.
