세균성 CRISPR-Cas9 시스템은 생명 과학자를 위한 실험 선택권을 실질적으로 증가시켰습니다. 그러나, 몇몇 CRISPR 접근은 개별 적인 세포로 다중 가이드 RNA의 동시 납품에 달려 있습니다. 문자열 어셈블리 gRNA 클로닝을 통해 단일 복제 단계에서 멀티플렉스 gRNA 발현 벡터를 간단하고 빠르게 생성할 수 있습니다.
그러나 STAgR은 간단할 뿐만 아니라 효율적이고 저렴하며 사용자 정의가 쉽습니다. 시작하려면, 오버행으로 STAgR DNA 문자열에 대한 전방 증폭 프라이머에 N20 gRNA 서열을 추가합니다. 센스 gRNA 서열을 미래 프라이머, 스캐폴드 포워드 프라이머, 종래의 스캐폴드또는 MS2 함유 스캐폴드용 SAM 포워드 프라이머에 5개의 프라임을 추가한다.
다음으로, 역방향 레퍼스트 N20 gRNA 서열을 역프라이머 서열에 추가하여 사용되는 특정 프로모터 및 문자열에 따라 RP 프라이머를 선택합니다. 깁슨 어셈블리의 개별 복제 조각을 생성하기 시작하려면 고충실도 버퍼의 10 마이크로리터를 튜브로 전송합니다. 10 밀리몰러 dNTP의 마이크로리터 1개와 100마이크로몰러 오버행 프라이머 의 0.25 마이크로리터를 추가합니다.
DNA 템플릿 문자열 또는 벡터의 10 나노그램과 1.5 마이크로리터를 DMSO를 추가합니다. 49.5 마이크로리터에 최종 부피를 가져올 충분한 물을 추가한 다음 HF 폴리머라제 0.5 마이크로리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 열순환기의 반응을 배양합니다.
그 후 PCR 반응에서 5.5 마이크로리터 알리쿼트복용을 한다. 모든 알리쿼트에 로딩 염료를 넣고 1%의 아가로즈 젤에 적재합니다. 크기 조정에 적합한 DNA 사다리를 적재하고 30분 동안 120볼트에서 적절한 젤 러닝 버퍼로 젤을 실행합니다.
젤이 실행되는 동안, 제한 효소와 함께 제공되는 완충제의 5 마이크로리터를 추가하고, 0.5 마이크로리터 DpnI를 나머지 44.5 마이크로리터의 벡터 PCR 반응에 추가하여 PCR 중에 사용되는 잔류 플라스미드 템플릿을 제거한다. 섭씨 37도에서 30~60분간 배양하세요. 앰플리턴이 올바른 크기인지 확인합니다.
DNA 정화를 시작하려면 PCR 제품의 마이크로리터 1개당 1.8 마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가하고 위아래로 파이프팅하여 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 자석을 사용하여 DNA 조각의 구슬을 잔류 액체와 분리합니다.
70%에탄올로 펠릿을 완전히 재차드리지 않고 헹구어 구슬을 씻습니다. 이 세척을 한 번 더 반복하십시오. 파이펫을 사용하여 에탄올을 모두 제거하고 펠릿을 건조하게 하십시오.
그런 다음 15~20마이크로리터의 물을 넣고 파이펫을 위아래로 넣고 펠릿을 혼합하고 용해합니다. 자석을 사용하여 구슬을 액체와 분리합니다. 명확한 상체를 새로운 튜브로 옮기십시오.
그 후, 분광계를 사용하여 DNA 농도를 결정합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 5배 이더스말 반응 버퍼를 준비합니다. 깁슨 어셈블리 마스터 믹스의 경우 5x 이더스 반응 버퍼320 마이크로리터와 697 마이크로리터의 물을 결합합니다.
T5 엑소뉴클레아제 3개, DNA 폴리머라제 20마이크로리터, Taq DNA 리게아제 160개 맥시롤리터 를 추가합니다. 어셈블리 마스터 믹스의 7.5 마이크로리터를 신선한 튜브로 옮기습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 벡터에 삽입하는 2.5 마이크로리터를 추가합니다.
샘플을 섭씨 50도에서 45~60분 동안 배양합니다. 그 후, 후속 변환을 위해 얼음 또는 섭씨 20도에 샘플을 저장합니다. 박테리아를 변형시킬 준비가 되면, 얼음 에 화학적으로 유능한 TOP10 E.Coli 박테리아를 해동하십시오.
다음으로, 깁슨 믹스의 마이크로 리터 50 유능한 박테리아의 마이크로 리터를 추가하고 튜브의 바닥을 부드럽게 가볍게 섞습니다. 얼음에 30분 간 배양하세요. 튜브를 42도 의 수조 또는 열 블록에 45 초 동안 놓고 박테리아를 열 충격을 가합니다.
그런 다음 튜브를 얼음에 다시 넣습니다. 박테리아에 SOC 배지 250 마이크로리터를 추가하고 30~45분 동안 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 회복하게 하십시오. 박테리아가 회복된 후에, 밀리리터 암피실린 당 100 마이크로그램을 포함하는 1.5% LB 아가 접시에 그(것)들을 접시.
밤에 37도에서 접시를 배양하십시오. 시작하려면 각 구조에 대해 200 마이크로리터 PCR 반응 튜브의 적어도 두 세트를 준비하십시오. 암피실린 밀리리터당 100 마이크로그램을 함유한 100마이크로리터 LB 배지로 반응 튜브 세트 중 하나를 채웁니다.
멸균 파이펫 팁을 사용하여, 하나의 세균 성 식민지에서 생물학적 물질을 긁어, 빈 200 마이크로 리터 PCR 반응 튜브의 바닥에 확산. 즉시 LB 배지를 포함하는 두 번째 대응 반응 튜브로 파이펫 팁을 전송합니다. 일부 박테리아가 LB 매체로 전달되는지 확인하기 위해 팁을 소용돌이시다.
나중에 사용할 수 있도록 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응 튜브당 PCR 마스터 믹스 10 마이크로리터를 준비합니다. LB 미디어없이 레이블이 붙은 PCR 반응 튜브에 PCR 마스터 믹스의 마이크로리터 10개추가됩니다.
써모사이클러를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응을 배양합니다. 그 후 증폭된 조각에 로딩 염료를 추가하고 1%의 아가로즈 젤에 적재합니다. 크기 조정에 적합한 DNA 사다리를 적재하고 30분 동안 120볼트에서 적절한 젤 러닝 버퍼로 젤을 실행합니다.
사용된 프로모터, gRNA 스캐폴드 및 N20 서열 의 수를 개별 크기로 합산하여 앰플리톤의 이론적 크기를 계산합니다. 콜로니 PCR의 결과에서 올바른 대역 크기에 따라 세균 클론을 식별하고 올바른 벡터를 수용 할 가능성이 있는지 여부를 확인합니다. 해당 100 마이크로리터 배양을 사용하여 밀리리터 암피실린당 100 마이크로그램을 함유한 2.5 밀리리터 하룻밤 LB 배양을 접종한다.
섭씨 37도에서 12시간 동안 배양하세요. 그런 다음 제조업체의 지시에 따라 상업용 플라스미드 미니 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하십시오. 이 절차에서, 문자열 조립 gRNA 복제는 gRNA 발현 플라스미드를 신속하게 생성하는 데 사용됩니다.
STAgR 조각을 획득하는 데 사용되는 PCR의 일반적인 결과는 여기에서 볼 수 있습니다. 6개의 앰플리톤은 선형 DNA 조각을 나타내며, 각각 그들의 끝에 개별 gRNA N20 서열을 함유하고 있다. 플라스미드 백본은 gRNA1 및 gRNA6의 표적 시퀀스와 함께 확장되므로 깁슨 어셈블리에 필요한 중복을 두 개의 다른 PCR에 보유합니다.
정제 후 벡터 및 삽입에 대해 적어도 하나의 마이크로그램의 DNA 수율을 달성할 수 있습니다. 깁슨 어셈블리 후, 세균 성 변형 결과 100 받는 번째 700 박테리아 식민지. 6개의 gRNA 카세트를 가진 STAgR 프로토콜에 따라 식민지 PCR를 통해 22개의 세균성 식민지의 대표적인 분석은 7개의 클론이 전체 조립을 위한 예상된 앰플리턴 크기를 나타낸다는 것을 나타냅니다.
다른 클론은 1~5gRNA 카세트를 포함하는 STAgR 벡터를 받았고, 하나의 클론은 완전히 비어 있습니다. 이 기술을 마스터하면 몇 시간 안에 이 기술을 수행할 수 있습니다. 제대로 수행, 그것은 작업 주 이내에 멀티 플렉스 gRNA 발현 벡터의 다중의 생성을 허용한다.
이 절차를 시도하는 동안 N20 오버행 프라이머의 올바른 할당 및 조합에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후, 당신은 당신의 자신의 멀티 플렉스 가이드 RNA 발현 벡터를 만드는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.
