이 방법은 췌장 적 정문 필드에서 췌장 리니지 분화, 성숙 및 재생에 대한 주요 질문에 대한 답변을 가질 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고품질 단세포 RNA 염기서열 분석 데이터의 생성을 위한 단일 췌장 축암 세포의 수집을 허용한다는 것입니다. 이 기술의 적용은 병리학적 조건에 췌장 내분비 단 하나 세포의 전사 분석을 통해 당뇨병과 다른 췌장 내분비 관련 질병의 치료로 확장됩니다.
이 방법의 시각적 데모는 관류에 대한 췌장의 좁은 담관에 바늘을 삽입하는 것이 까다로울 수 있기 때문에 중요합니다. 배아의 날 17.5 배아. 복강을 여은 후 팔꿈치 핀셋을 사용하여 내장 조직을 감기 PBS를 포함하는 6 센티미터 검은 바닥 접시로 옮춥시다.
집게를 사용하여 내장 조직에서 췌장을 분리하십시오. 그리고 췌장 조직을 차가운 콜라게나아제 용액 5밀리리터를 포함하는 20 밀리리터 바이알에 넣습니다. 산후 일 0에서 15 마우스의 경우, 조직을 콜라게나아제에 넣기 전에 췌장의 모든 엽을 주의 깊게 해부하십시오.
산후 일 18 받는 일 60 마우스에 대 한, 먼저 xiphoid를 제거 하 고 복 강의 오른쪽에 창 자를 추출. 담낭과 일반적인 담관을 노출하기 위해 각 측면에 간 좌측 및 오른쪽 내측 엽을 밀어 넣습니다. 그리고 십이지장 과 작은 선박 클램프 한 쌍으로 십이지장 간질은 담관이 십이지장으로 들어가는 부위를 측면으로 합니다.
다음으로, 차가운 콜라게나제 용액이 있는 30 게이지 바늘을 장착한 5 밀리리터 주사기를 적재합니다. 그리고 현미경을 사용하여 담낭에 바늘 팁을 삽입하십시오. 일반적인 담관을 통해 바늘을 신중하고 원활하게 조작합니다.
그리고 플런저를 우울하게 하여 마우스 크기에 따라 콜라게나제 용액의 1~5밀리리터로 췌장을 인페징합니다. 모든 솔루션이 침투되면 집게를 사용하여 췌장을 신선한 차가운 콜라게나아제 용액 5밀리리터를 포함하는 20 밀리리터 바이알로 즉시 전송합니다. 모든 췌장 조직이 수집되면 37도의 수수 욕조에 바이알을 넣고 3~5분간 부드러운 흔들림을 냅니다.
그런 다음 0.25 밀리미터 나일론 여과기를 통해 소화된 제품을 새로운 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 필터링합니다. 얼음 차가운 PBS가 들어있는 20 밀리리터 주사기를 사용하여 스트레이너를 철저히 씻으십시오. 산후 일 18 받는 일 60 췌장, 원심 분리 필터 된 샘플을 원심 분리 하 고 감기 PBS의 30 밀리리터에서 조직을 다시 중단.
그런 다음 조직 현탁액을 6센티미터 검은 바닥 접시로 분해하고, 200 마이크로리터 파이펫과 해부 현미경을 사용하여 소량의 감기 PBS를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮길 섬을 선택합니다. 배아일 17.5 산후 15일 췌장의 경우, 여과된 췌장 조직을 원심분리하고 트립신-EDTA 용액의 펠릿을 37°C의 수조에서 4분간 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 200 마이크로리터 파이펫으로 1분 동안 펠릿을 부드럽게 평가하고, 소화를 멈추기 위해 부드러운 소용돌이로 차가운 태아 소 혈청의 0.5배를 첨가합니다.
그런 다음 원심 분리에 의해 소화를 수집하고 유동 세포측정에 의해 정렬을위한 5 밀리리터 FACS 튜브에서 FACS 버퍼의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 단일 세포 따기 및 용해의 경우, aliquot 갓 준비 된 셀 리시스 버퍼를 8 개의 스트립 PCR 튜브로 버퍼링하고 단일 셀을 각각 전달합니다. RNA의 방출을 위해 세포를 lyse하는 견본을 소용돌이, 4섭씨에서 30 초 동안 원심분리, 얼음에 즉각적인 저장.
역전사의 경우, 리스를 섭씨 72도에서 3분간 배양한 다음 얼음에서 1분간 배양합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 30초 동안 간략하게 원심분리하고 각 샘플에 5.7 마이크로리터의 역전사 믹스를 추가하여 각 샘플에 대해 총 부피를 10 마이크로리터로 가져옵니다. 부드러운 소용돌이와 원심분리 후 샘플을 열순환기에 적재하고 역전사 프로그램을 시작합니다.
폴리머라제 연쇄 반응 전암증폭 또는 PCR의 경우, 첫 번째 가닥 반응을 포함하는 각 샘플에 PCR 믹스 15마이크로리터를 추가하고 부드러운 소용돌이와 원심분리를 합니다. 그런 다음 샘플을 열순환기로 로드하고 PCR 프로그램을 시작합니다. PCR 정화의 경우, 각 샘플에 재부유 된 DNA 정화 구슬 25 마이크로 리터를 추가하고 소용돌이에 의해 잘 섞습니다.
그런 다음 재빨리 실온에서 샘플을 회전하여 구슬의 정착을 피하면서 액체를 수집합니다. 실온에서 5분 후, 샘플을 적절한 자기 스탠드에 놓고 용액이 명확할 때 상체를 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 워시당 80%에탄올로 준비된 200마이크로리터200마이크로리터로 30초 세척2개로 구슬을 씻습니다.
그리고 두 번째 세척 후 나머지 에탄올을 폐기하십시오. 구슬이 공기건조되면 11 마이크로리터의 핵을 첨가하여 구슬에서 DNA 표적을 엘루트하고 소용돌이를 피하십시오. 그런 다음 샘플을 신속하게 원심 분리하고 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자기 스탠드로 반환하고 각 샘플의 10 마이크로리터를 새로운 PCR 튜브로 전송합니다.
성공적으로 증폭된 cDNA는 500개의 기본 쌍 보다 전체 길이를 가지며 1.5~2킬로베이스 쌍으로 보강되어야 합니다. 더욱이, 인슐린 1RFP 플러스 세포에서 관찰된 cDNA의 500~600개의 염기 쌍 농축이 일반적으로 인슐린 전사체를 나타낼 수 있다. 그러나, 100개의 염기 쌍 근처의 cDNA 단편은 일반적으로 과도한 프라이머에 의해 유발되고 DNA 정화 단계를 반복하여 제거되어야 하는 프라이머 디머이다.
100과 500개의 염기 쌍 사이의 cDNA 단편은 일반적으로 저하된 cDNA를 나타내며, 이는 RNase 오염과 같은 나쁜 세포 상태 또는 지역 문제로 인해 발생하며 배제되어야 합니다. 시퀀싱을 위한 cDNA 라이브러리의 정제 후, 250에서 450개의 염기 쌍에 이르는 cDNA는 정제의 제1 및 제2 라운드에 DNA 정화 구슬의 첨가를 통해 얻을 수 있다. DNA 비드 정제 후, 시퀀싱 품질 평가 중에 시퀀싱 품질 점수가 30을 초과해야 한다.
다운스트림 분석을 위한 고품질 세포를 얻기 위하여는, 0.5백만 미만의 매핑된 읽기 또는 4 이하의, 000검출된 유전자를 가진 세포는 제외되고, 세포의 다른 단의 특성화 및 주요 성분 분석 및 계층적 클러스터링 후에 다른 단에서 이질적으로 표현되는 유전자의 식별을 용이하게 합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 소화를 통해 유슬을 피하고 단일 세포 절차 동안 RNase 무료 환경을 유지하기 위해 콜라게나아제 소화 전에 신속하게 췌장을 perfuse하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, islet 화상 진찰 및 배양같이 그밖 방법은 islet 구조의 시각화를 용이하게 하고 세포 반응 및 약 자극을 검토하기 위하여 수행될 수 있습니다.
개발 후, 이 기술은 포유류의 당뇨병 진행뿐만 아니라, 유방 계보 발달 및 재생의 메커니즘을 탐구하는 췌장 연구 분야의 연구자를위한 길을 열었습니다.
