이 작업은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원과 호주 정부 NHMRC IRIISS를 통해 가능했으며 국립 보건 의료 연구 위원회 (ALW #1120300)와 호주 연구 위원회 (KJH #FT190100265)의 자금 지원을 통해 지원되었습니다. 저자는 모나시 동물 연구 플랫폼, 모나시 히스토로지 플랫폼 및 모나시 마이크로 이미징 시설의 기술 적 지원을 인정하고 싶습니다.

난소는 암컷 C57BL6J 마우스로부터 채취되었다. 모든 동물 절차 와 실험은 동물의 치료 및 사용을위한 NHMRC 호주 관행 규범에 따라 수행되었으며 모나시 동물 연구 플랫폼 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 초보 여포 난모를 고갈하는 것으로 나타난 화학요법 제은입체학 11 및 직접 카운트12,13을 사용하여 동일한 동물의 두 가지 계산 방법을 비교하는 데 사용되었습니다. 여성, 8주된 (젊은 성인) 마우스는 사이클로포스파미드의 75 mg/kg/체급의 단일 내회관 주사 이전에 체중이 감소하거나 식염수 차량 제어(n=5/group)를 측정하였다. 이 복용량은 원시 여포의 대략 50% 고갈을 일으키는 원인이 되기 위하여 보였습니다, 그러나 마우스에 있는 이환율 또는 사망을 일으키는 원인이 되기 위하여 보고되지14. 난소는 치료 후 48시간 후에 수확되었습니다. 각 동물의 난소 1개는 24시간 동안 10%(v/v) 중성 버퍼링 포름틴 용액으로 고정되었으며, 다른 하나는 부인의 용액에 24시간 동안 고정되었다. 조직은 글리콜메타크릴레이트 수지에 내장되어 20 μm에서 직렬로 분리되거나 파라핀에 넣고 5 μm에서 직렬로 단면시켰다. 모든 조직은 주기적인 산 쉬프와 헤마톡시린으로 염색되었다.
1. 조직학적 준비: 고정, 처리, 내장 및 마우스 난소
<ol><li>난소 자체를 손상시키거나 자르지 않고 난소와 주변의 모든 지방을 다듬어 마우스 난소를 해부하십시오. 필요한 경우, 이 단계에 대해 해부 현미경 및 미세 블레이드를 사용하십시오(그림1A).</li>
	<li>조직을 70%에 탄올로 옮기기 전에 부인의 고정(stereology) 또는 24시간 동안 포르말린고정(직접개수)을 포함하는 작은 라벨이 부착된 튜브에 즉시 배치하여 조직을 수정합니다. 참고: 폴릭알 형태는 부인의 고정 난소 조직 내에서 가장 잘 보존되며, 글리콜메타크릴레이트 수지(그림2)에내장되어 있습니다.</li>
	<li>전체 고정 난소를 처리하고 표준 조직학적 프로토콜을 사용하여 직접 카운트에 대한 입체학(보충 파일 1)또는 파라핀 왁스글리콜메타크릴레이트 수지에 포함. 주의: 수지는 독성이 있으므로 모든 조직 처리 단계가 연기 후드로 수행되고 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>유리 나이프(도1D)가장착된 특수 수지 메타크릴레이트 마이크로톨메(도1C)를사용하여 두꺼운 글리콜메타크릴레이트 수지 섹션(예를 들어, 20 μm)을 철저히 절단한다. 스테레오로지용 유리 현미경 슬라이드에 정기적으로 섹션(예:3rd 섹션마다)으로 섹션을 수집합니다.</li>
	<li>표준 마이크로토메를 사용하여 얇은 파라핀 섹션(예: 4-6 μm)을 자른다. 직접 여포 카운트에 대한 유리 현미경 슬라이드에 정기적으로 간격 (예를 들어, 매 9단 섹션)에서 조직 섹션을 수집합니다.</li>
	<li>주기적인 산 쉬프와 헤마톡시린(보충 파일 2)로슬라이드를 얼룩.</li>
	<li>파라핀 섹션에 대한 표준 DPX, 또는 글리콜메타크릴레이트 수지섹션(그림 1E)용두꺼운 DPX가 있는 커버슬립. 주의: 글리콜메타크릴레이트 수지 DPX는 위험하므로 연기 후드에 이 단계를 수행하십시오. 참고: 글리콜메타크릴레이트 수지 DPX는 매우 점성입니다. 유리 커버슬립은 DPX가 균등하고 얇게 분산되도록 주걱으로 눌러 단단히 부착되어야 하며, 커버슬립(도 1F)아래에기포가존재하지 않는다.</li>
</ol>2. 광학 분획기사용 원시 여포 수의 스테레오학적 추정
<ol><li>컴퓨터, 다중 제어 장치, 카메라 및 입체 설정 내의 광원을 켜고 현미경 목표를 낮은 배율(예: 10x)으로 설정합니다.</li>
	<li>스테레오로지 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>현미경 단계에 첫 번째 슬라이드를 단단히 놓습니다.</li>
	<li>카메라 설정 패널(보조도 1A)에서노출 미만의 자동 노출을 확인하여 광 노출을 조정합니다. 또는 빛 노출을 수동으로 조정합니다.</li>
	<li>조이스틱을 사용하여 첫 번째 조직 샘플을 찾고 샘플을 집중시합니다.</li>
	<li>더 많은 설정(카메라 설정 패널 의 오른쪽 하단에 있음)을 클릭한 다음 화이트 밸런스를 클릭하고 자동(추가 그림 1B)을클릭하여 흰색 균형을 조정합니다. 또는 더 많은 설정 버튼(또는 추가 설정의 영역 선택)에 인접한 화이트 밸런스 버튼을 클릭하여 섹션의 흰색 영역을 선택하여 흰색 균형을 수동으로 설정합니다.</li>
	<li>프로브 드롭 다운 메뉴로 이동하여 광학 분수기 워크플로우를 클릭합니다. 그런 다음 새 프로젝트 시작을 클릭하고 확인을 클릭합니다.
	<ol>
<li>기존 샘플링 구성이 저장된 경우 샘플링 매개 변수에서 예 | 클릭합니다. ... 원하는 샘플링 구성을 선택합니다.</li>
		<li>그렇지 않은 경우 아니오를 클릭하고 수동으로 직렬 섹션정보(보충 도 1C)를입력하고 2.13 단계에서 프로브 구성을 정의합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다음을클릭하고 현미경을 낮은 배율로 설정하고 드롭다운 메뉴에서 10배 배율을 선택합니다.</li>
	<li>다음을클릭한 다음 전체 난소 섹션을 추적합니다 - 섹션을 클릭하고 마지막에 왼쪽 클릭으로 시작하여 오른쪽 윤곽닫기를 선택하고 선택합니다.</li>
	<li>다음을클릭하고 현미경을 높은 배율로 설정하고 드롭다운 메뉴에서 100x 오일 배율을 선택합니다.</li>
	<li>슬라이드의 조직 섹션에 오일 한 방울을 놓고 현미경 목표를 100배율로 이동합니다.</li>
	<li>라이트 노출(2.4단계)을 조정하고 다음을 클릭합니다.</li>
	<li>프로브 구성을 정의하기 위해 샘플링 매개 변수를 설정합니다. 여기서, 계수 프레임은 47.5 μm x 47.5 μm(2,256.25 μm2)으로설정되었고, 걸음 길이는 100 μm x 100 μm(10,000 μm 2)(보충도2)로설정되었다. 샘플링 매개 변수가 설정되면 템플릿을 저장하고 후속 분석 세션 동안 2.7단계에서 다시 엽니다.</li>
	<li>시작 계산(추가 그림 1D)을클릭합니다. 샘플 의 상단에 초점을 맞추고 확인을 클릭하고 계산을 시작합니다.</li>
	<li>초점 손잡이를 사용하여 10 μm 샘플링 깊이를 이동하고 난모 핵이 초점을 맞춘 원시 여포를 계산합니다. 다음 영역으로 이동하려면 다음 영역을 클릭합니다.<ol>
<li>난소세포가 편평상피 (평평한) 과립 세포에 둘러싸여 있지만, 어떤 입체 과립 세포(도 2A)에둘러싸여있는 경우 원시로 여포를 분류합니다. 참고: 원시 여포는 중질/과도기 여포와 구별되며, 이는 입체와 편평상피 과립세포(도2B)와1차 여포의 조합을 구성하며, 이는 주로 계류성 과립세포(그림2C)에의해 포위된다. 이러한 여포 클래스는 별도로 정량화되어야 합니다.</li>
		<li>난염 핵이 보이는 여포만 계산합니다. 난소 핵은 카운팅 프레임 내에 나타나거나 카운팅 프레임의 녹색 포함 선을 터치해야한다(보충 도 1E, F).</li>
		<li>난소 핵이 카운팅프레임(보충 도 1G)외부에 떨어지거나 카운팅 프레임의 적색 배제 라인을 터치하는 경우, 이 여포를 계산하지 마십시오.</li>
		<li>외인성 화학 물질(예를 들어, 화학요법)에 반응하여 원시 여포 고갈을 평가할 때, 계산된 모든 여포가 건강하고 따라서 정상 형태학이 있는지 확인하십시오(그림2). 비정상 또는 무성 여포를 따로 계산합니다. 종종, 여포 죽음은 화학요법과 같은 모욕에 의해 유도되고, 다폐 여포의 정량화는 건강한 여포와 수폐여포를 구별하기 위하여 별도로 얻어져야 하며, 건강한 여포만이 난소예비15를포함하기 때문에.</li>
	</ol></li>
	<li>해당 섹션에서 계산이 완료되면 다음 중 하나를 수행합니다.<ol>
<li>새 섹션 추가를클릭한 다음 2.3단계로 돌아가 계산에 대한 다음 섹션을 설정합니다.</li>
		<li>카운트가 완료되어 세션을 종료한 경우를 클릭합니다. 목표를 10배로 되돌리고, 스테레오로지 소프트웨어를 종료하고 광원, 카메라, 다중 제어 장치 및 컴퓨터를 끕니다.</li>
	</ol></li>
	<li>전체 난소에서 샘플링된 각 조직 섹션에서 합계 원시 여포 번호(Q)를 얻은 다음 스프레드시트를 사용하여 아래 방정식을 사용하여 각 복제 동물(N)4로부터최종 값을 얻습니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">어디: N = 난소 내의 총 추정 여포 수입니다. Q = 원시 원시 여포 수입니다. f1 = 샘플링 간격. 모든 3rd 섹션은 따라서 샘플링되었다 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> . f2 = 계산 프레임(샘플 영역)과 스테퍼 간의 관계, 로 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> 계산된 . 시료면적은 2256 μm 2(47.5 μm x 47.5 μm)이고 스테퍼 면적은 10000 μm2(100 μm x 100 μm)였다. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> f3 = 샘플링된 난소 섹션의 분수. 20 μm 단면도의 10 μm을 샘플링했기 때문에, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . 따라서. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> 참고: 이 프로토콜은 널리 인용된 입체 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 이러한 스테레오학적 분석 원칙을 적용하는 방법을설명합니다. 그러나 다른 스테레오학적 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 난소 여포의 입체 분석 중에 적용 된 원칙은 매개 변수를 설정하는 데 사용되는 소프트웨어에 관계없이 동일합니다. 100개 이상의 물체가 성인 마우스 난소4에계산될 때 가장 정확하며, 이는 10%미만의추정치에 대한 오차 계수를 16% 미만으로 제공한다. 여기에 설명된 샘플링 매개 변수는 최소 약 100개의 개체(즉, 원시, 과도기 및 1차 여포)를 제어 성인 야생형 C57BL6J 난소에서 계산할 수 있도록 최적화되었습니다. 분석할 섹션의 간격 및 수 및 샘플링된섹션(17)내에서 광학 단종의 수와 같은 최적의 샘플링 파라미터를 확립하기 위한 작은 샘플 크기를 포함하는 파일럿 스터디연구가 수행될 수 있다.</li>
</ol>3. 직접 난소 여포 수에 의한 원시 여포 수 추정
<ol><li>현미경 슬라이드를 표준 광 현미경 아래에 단단히 놓고 직접 카운트를 수행하여 원시 원시 여포 번호를 얻습니다.<ol>
<li>모낭을 명확하게 볼 수 있고 편평상피 (평평한) 과립 세포로 둘러싸여 있지만, 어떤 입체 과립 세포(도 2D)에의해 포위되는 경우 초보로 여포를 분류합니다. 참고: 원시 여포는 중위/과도기 여포와 구별되며, 이는 입체와 편평상피 과립세포(그림2E)와1차 여포의 조합을 구성하며, 이는 주로 계류성 과립세포(그림2F)에의해 포위된다. 이러한 여포 클래스는 별도로 정량화되어야 합니다.</li>
		<li>계산된 모든 여포가 건강하고 정상적인형태(그림 2)를가지고 있는지 확인합니다. 건강한 여포만이 난소 보호구역을 구성하기 때문에 비정상적 또는 다중 여포를 따로 세어보아 두는 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, 이미지 파일을 열어 카운트를 수행하기 위해 전체 난소 조직 섹션의 여러 또는 스티치 고전력(예를 들어, 20x) 광마이크로그래프를 취하십시오. 이 작업은 수동으로 수행하거나 자동화된 슬라이드 스캐너를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>소정의 간격으로 전체 난소로부터 샘플링된 각 조직 섹션에서 합계 원시 여포 번호(Q)를 가져옵니다. 샘플링 분획의 반역으로 이 숫자를 곱하여 아래 방정식을 사용하여 각 복제 동물(N)에 대한 최종 값을 얻습니다. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">어디: N = 난소 내의 총 추정 여포 수입니다. Q = 원시 여포 수(각 개별 유형의 별도 계산). f1 = 샘플링 간격. 매9단 섹션은 이렇게 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> 샘플링하였다. 따라서. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"></li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

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이 문서에서는 마우스 원시 여포, 입체학 및 보다 일반적으로 사용되는 직접 여포 계포 방법을 통합하기 위한 금 표준 기술에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 화학요법 치료는 동일한 동물로부터 좌우 난소 내에서 이 두 가지 다른 방법에서 얻은 결과를 비교하고 대조하기 위해 사용되었다. 두 방법 모두 원시 여포 수의 높은 동물 간 가변성을 드러냈습니다. 난소 예비의 중요한 고갈은 입체?...

난소의 원시 여포 내에 저장된 미숙하고 메이오티컬하게 체포된 난모세포는 여성 생식선을 위한 저장 장치이며 개인의 평생 난소 보호구역으로 구성됩니다. 원시 여포 수는1세또는 대체로 공기, 식품 및 물2의일부 의약품 및 환경 독성물질을 포함한 외인성 화학 물질에 노출된 후 조기에 고갈될 수 있다. 원시 여포 수가 유한하다는 점을 감안할 때, 난소 안에 존재하는 여포의 양과 질은 주로 여성의 불임과 자손 건강을 결정합니다. 따라서, 여성의 원시 여포 수의 정확한 정량화는 난소 예비군에 외인성 모욕의 오프 타겟 영향을 평가하기 위해 필수적이다.
여성의 경우, 전체 난소의 분석은 일반적으로 불가능하므로 난소 예비군의 비침습적 대리 측정은 임상 환경에서 활용되어야 합니다. 항Mϋllerian 호르몬(AMH)은 가장 널리 사용되는 대리 바이오마커 임상3이다. 혈청 AMH 수준은 종종 고급 모성 나이의 여성에서 측정, 또는 화학 요법과 같은 암 치료 전후. 그러나, AMH는 원시 여포가 아닌 여포를 성장시킴으로써 생성되며, 따라서 혈청 수준은 절대 원시 여포 수에 대해 알리지 않습니다.
설치류와 같은 작은 동물 모델에서난소 여포를 세는 여성의 원시 여포 수를 정확하게 결정하는 방법이 없기 때문에 외인성 모욕이 원시 여포에 미치는 영향을 평가하는 필수적인 연구 도구로 남아 있습니다. 불행하게도 그래도, 설치류 모델의 원시 여포 번호의 문학을 통해 보고서는 매우가변4입니다. 이에 대한 주요 이유는 널리 고용 된 계산 방법의 기술적 차이를보고된다. 주로, 쥐에 있는 원시 여포를 열거하기 위한 문헌에 기술된 2개의 다른 기술이 있습니다. 여기에는 분수기 광학 디스섹터 방법을 사용하는 입체학및 직접 여포 수가 포함됩니다.
입체학은 체계적인 균일 한 무작위 샘플링5를사용하기 때문에 금 본위제로 널리 간주되며, 전체 마우스 또는 쥐 난소4,6,7에서원시 여포 수를 정량화하는 가장 정확한 방법입니다. 입체학은 관심 있는 개체의 3차원 구조를 차지하기 때문에 편견이 없습니다8. 광학 분수/분수기 방법을 사용하여 전체 마우스 난소의 알려진 분수 내에서 두꺼운 조직 섹션(예를 들어, 20 μm)을 사용하여 원시 여포를 정량화하기 위해 3가지 수준의 샘플링이 적용됩니다. 첫째, 샘플링 간격은 무작위 시작(예: 매3rd 섹션)에서 선택됩니다(샘플링 분획 1, f1)4. 그런 다음 이 시점에서 전체 난소를 통해 체계적이고 균일한 방식으로 단조로 섹션을 샘플링합니다. 이어서, 편견없는 카운팅 프레임은 난소 섹션 위에 중첩되고 정의된 무작위 계수 그리드(샘플링 분수 2, f2)8을따라 점진적으로 이동한다. 마지막으로, 단면 두께의 공지된 분획은 광학적으로 샘플링(예를 들어, 10 μm) 및 이 영역 내의 여포(sample 분획 3, f3)4를계산한다. 원시 여포 수는 최종 값을 얻기 위해 이러한 샘플링 분획의 반역으로 곱됩니다. 이 방법은 스테레오소프트웨어가 구동하는 전동 단계가 있는 현미경을 포함한 전문가 교육 및 장비가 필요합니다. 조직은 전문 부인의 고정물로 보존되어야 하며, 글리콜메타크릴레이트 수지에 내장되어 유리 칼로 글리콜메타크릴레이트 수지 마이크로톨메를 사용하여 두꺼운 조직 섹션을 절단할 수 있도록 해야 합니다. 이 방법은 난소와 여포9의3차원 형태 구조를 가장 잘 보존하기 위해 조직 수축 및 변형을 고려하여 설계되었습니다.
직접 여포 카운트는여포(10)를세는 데 가장 자주 사용되는 방법입니다. 일반적인 고정제(즉, 포르말린)를 사용할 수 있으며, 4-6 μm 사이의 두께로 표준 마이크로토메를 사용하여 파라핀 왁스 임베드 및 철저한 직렬 단면을 사용할 수 있습니다. 여포는 정의된 간격으로 전체 조직 섹션에서 체계적으로 계산된 다음 샘플링 간격의 역으로 곱하여 총 여포 추정치를 얻습니다. 이 방법은 빠르고 쉽고 보관된 조직을 사용하여 수행할 수 있으며 표준 조직학 기술을 사용하여 준비할 수 있습니다. 표준 이미징 기능을 갖춘 가벼운 현미경만 필요합니다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고 직접 여포 계수는 입체학의 정확성과 엄격한 계수 매개 변수가 부족하여 조사자 편견에 더 취약합니다. 추가적으로, 조직은 처리 도중 수축 및 변형을 겪을 수 있고, 난소의 무결성 그리고 형태를 방해하고 이렇게 여포 분류 및 정량화를 어렵게 만듭니다.
이 문서의 목적은 마우스 난소의 원시 여포 수를 정량적으로 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 방법을 설명하는 것입니다: 입체학 및 직접 여포 계수. 우리는 이 두 가지 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하고, 우리의 분야에서 재현성을 향상시키고 연구원이 자신의 연구에 가장 적합한 계수 방법의 정보에 입각한 결정을 내릴 수 있도록하기 위해, 자신의 강점과 약점의 일부를 강조 할 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

성적으로 재현된 여성 포유류는 평생 난모세포 공급으로 태어납니다. 미숙하고, 정지성 난모세포는 여성 생식선의 저장 단위인 원시 여포 내에서 발견됩니다. 그(것)들은 비 신재생적입니다, 그러므로 출생시 그들의 수 및 손실의 후속 비율은 주로 여성 비옥한 수명을 지시합니다. 여성과 동물의 원시 여포 수의 정확한 정량화는 난소 보호구역에 대한 의약품과 독성물질의 영향을 결정하는 데 필수적입니다. 또한 기존 및 신흥 불임 보존 기술의 필요성과 성공을 평가하는 데도 필요합니다. 현재 여성의 난소 예비군을 포함하는 원시 여포의 수를 정확하게 측정하는 방법은 존재하지 않는다. 또한, 실험을 위해 큰 동물 또는 멸종 위기에 처한 종에서 난소 조직을 얻는 것은 종종 가능하지 않습니다. 따라서, 마우스는 그러한 연구를 위한 필수적인 모형이 되고, 전체 마우스 난소에 있는 원시 여포 수를 평가하는 기능은 중요한 공구입니다. 그러나 문헌에서 마우스 난소의 절대 여포 숫자에 대한 보고는 매우 가변적이기 때문에 데이터를 비교 및/또는 복제하기가 어렵습니다. 이것은 긴장, 나이, 처리 단, 고용된 계산의 방법에 있는 기술적인 다름을 포함하여 요인의 수 때문입니다. 이 문서에서는 분획기/광학 디스섹터 기술에 의존하는 [1] 입체학: 조직학적 섹션을 준비하고 마우스 난소에서 원시 여포를 계산하기 위한 단계별 교육 가이드를 제공합니다. 및 [2] 직접 카운트 기술. 각 방법의 주요 장점과 단점 중 일부는 현장에서 재현성을 개선하고 연구원이 연구에 가장 적합한 방법을 선택할 수 있도록 강조될 것입니다.

여포 고갈의 잘 특징적인 모형이 이용되었고, 이에 따라 젊은 성인 암컷 마우스는 사이클로포스파미드 화학요법의 단일 용량을 투여하였고, 또는 식염수 차량 제어(n=5/group) 및 두 난소모두 48시간 후에 각 동물로부터 수확하였다. 동물당 난소 1개는 각각의 두 가지 방법에 대해 1단계에서 설명한 대로 제조되었다: 스테레오로지 또는 직접 카운트. 각 동물의 왼쪽과 오른쪽 난소는 각 그룹에 무작위?...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

여기에서, 우리는 고정 마우스 난소 조직의 정확한 여포 계산을 위한 2개의 다른 기술을 기술하고, 비교하고, 대조합니다.

성인 마우스 난소의 정확한 여포 열거

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K 조회수.  Monash University. 여기에서, 우리는 고정 마우스 난소 조직의 정확한 여포 계산을 위한 2개의 다른 기술을 기술하고, 비교하고, 대조합니다.

비디오: Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

연구

발생학

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Micro-CT 화상 진찰을 위한 성인 및 초기 산후 마우스 폐의 혈관 주조

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

양에서 성인 및 프레우버탈 난소에서 채취한 생체외 성숙 난소의 진동

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