35S 라벨메티오닌과 시스테인을 이용한 방사성 펄스 추격은 여전히 살아있는 세포에서 시간이 지남에 따라 단백질 생합성을 조사하는 유일한 생화학적 방법입니다. 단백질 생합성은 번역, 접이식 및 조립, 인신매매 및 분해를 모두 다룹니다. 방사성 펄스 추격전과 이황화 결합 형성 및 아세틸화와 같은 공동 및 번역 후 단백질 수정의 분석을 결합하면 단백질의 믿음을 시간이 지남에 따라 조사하기 위한 민감하고 정량적인 분석을 제공합니다.
이 절차에는 좋은 초점과 실험 처리가 필요합니다. 버퍼, 방사성 작업 공간 및 명확한 일정과 같은 좋은 준비는 중요합니다. 이 비디오는 방사성 펄스 추적 프로토콜의 어깨 보기를 통해 명확합니다.
절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 pHd 후보인 후이잉 여(Hui Ying Yeoh)가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 종자 transfect 및 배양 셀을 시드합니다. 펄스 추적 하기 전에 현미경을 통해 세포를 검사 합니다.
다음으로, 세척 버퍼의 두 밀리리터로 설거기를 씻는다. 그리고 세포에 기아 배지의 2 밀리리터와 15 분 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 가습 된 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 펄스 추적 설정이 순서대로 되어 있는지 확인합니다.
미리 따뜻하게 섭씨 37도까지 미리 데운 수조의 랙으로 요리를 옮기. 요리가 물과 접촉하고 있는지 확인하지만, 떠있지 않습니다. 그런 다음 타이머를 시작합니다.
40초에서 기아 매체를 흡인합니다. 마이크로 파이프를 사용하여 600 마이크로리터의 펄스 용액을 그립니다. 정확히 1분 만에 펄스 용액을 접시 중앙에 부드럽게 추가합니다.
기아 매체를 제거하고 나머지 요리에 대한 펄스 용액을 1분 간격으로 추가하는 과정을 반복합니다. 정확히 11 분에서 펄스 추적 계획에 따라, 0 분 추적 샘플을 제외하고, 모든 다음 요리에 대한, 접시에 직접 추적 매체의 두 밀리리터를 추가합니다. 추적 매체를 흡인하고 신선한 추적 매체의 두 밀리리터로 대체합니다.
남은 모든 요리에 대해 1분 간격으로 이 과정을 반복합니다. 타이머가 정확히 16분을 읽을 때, 펄스 매체 위에 0 분 추적 접시에 직접 체이스 매체의 두 군대를 추가하여 라벨을 중지합니다. 즉시 매체를 흡인합니다.
접시를 냉각 된 알루미늄 접시에 옮기고 얼음 냉간 정지 버퍼 두 마리를 추가합니다. 다른 모든 요리를 섭씨 37도에서 인큐베이터로 옮기. 각 추적 접시를 인큐베이터에서 각 추격 시간이 끝나기 2분 전에 수조로 옮기다.
각 접시에 대한 정확한 추적 시간에, 추적 매체를 흡인하고 냉각 알루미늄 접시에 접시를 전송합니다. 얼음 콜드 스톱 버퍼 2밀리리터를 추가합니다. 모든 접시를 얼음 위에 두고 세포를 lyse 할 시간이 있을 때까지 버퍼를 중지하십시오.
그런 다음 정지 용액을 흡착하고 모든 접시를 씻으십시오. 얼음 냉간 정지 용액 2 밀리리터와 동시에 3. 정지 용액을 완전히 흡인하고 한 번에 600 마이크로 리터의 용해 버퍼를 두 접시에 추가합니다.
셀 스크레이퍼를 사용하여 접시 표면을 철저히 긁어 내지만 부드럽게 섞어 줍니다. 각 접시에서 신선한 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 lysate를 옮김합니다. 15, 000 ~ 20, 000 G의 원심분리기는 핵을 펠릿하는 데 10분 동안 섭씨 4도에서 000 G.
서스펜션 세포에 대한 펄스 추격을 위해 1개의 50 밀리리터 튜브에서 시간당 5백만 개의 세포를 수집한다. 텍스트에 설명된 대로 기아 절차를 수행합니다. 수조에서 15 분 동안 기아 시술 후 타이머를 시작합니다.
정확히 1 분, 세포를 포함하는 튜브에 직접 희석되지 않은 라벨의 275 마이크로 큐피를 추가하고 혼합 소용돌이. 정확히 11분 만에 4밀리리터의 체이스 미디어를 추가하여 라벨링을 중단합니다. 그리고 즉시 라벨링을 중지하는 얼음 차가운 정지 솔루션9 밀리리터를 포함하는 얼음에 15 밀리리터 튜브에 밀리리터를 전송합니다.
각 연속 추격 시간 지점에 대한 정지 솔루션의 아홉 밀리리터를 포함하는 얼음에 튜브에 추격의 1 밀리리터를 전송하는이 과정을 반복합니다. 면역 침전 후, 마지막 세척을 완전히 흡인. TE 버퍼 및 소용돌이의 20 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다.
감소 제고없이 두 개의 X 샘플 버퍼20 마이크로 리터를 추가합니다. 샘플을 소용돌이로 간 후 섭씨 95도에서 5분간 가열합니다. 샘플을 다시 소용돌이시다.
원심분리기는 실온에서 12, 000배 G로 1분 동안. 500 밀리머 DDT의 마이크로리터 1개를 포함하는 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 감소되지 않은 체퍼나탈19마이크로리터를 전달합니다. 필요한 경우 모든 액체가 바닥에 있도록 샘플을 신속하게 원심 분리합니다.
그리고 5 분 동안 섭씨 95도에서 가열합니다. 감소된 샘플을 식힌 다음 소용돌이를 식힙니다. 원심분리기는 1분 동안 실온에서 12배, 000배 G의 감소 및 비감소 시료를 모두 한 다음 모든 샘플에 1개의 어금니 NEM의 1.1 마이크로리터를 추가합니다.
이 연구에서는 방사성 펄스 추적 접근법이 단백질 접기 및 운반을 손상시키지 않는 세포에서 분석하는 데 사용됩니다. HIV1 GP120의 접이식 및 분비은 부착된 펄스 추격전에서 여기에 표시됩니다. 비감소 젤은 GP120의 산화 접기를 나타낸다.
펄스 라벨링 직후, 젤에서 더 높은 확산 밴드로 나타납니다. 추격이 진행됨에 따라, 밴드는 GP120에서 기본적으로 접힌 것을 나타내는 타이트 한 밴드에 축적 될 때까지 더 확산 접이식 중간체를 통해 젤 아래로 이동합니다. 이것은 이황화물 결합의 형성이 단백질의 압축성을 증가시켜 완전히 감소된 단백질보다 빠르게 이동하게 함에 따라 발생합니다.
감소 젤에, 이황화물 결합 및 모든 분자 감소 하 고 mobiilty에 영향을 주지 않습니다. 따라서 이동성의 차이는 분자 질량의 변화의 결과일 뿐입니다. 감소된 신호 펩타이드 아클라베드 형태에서 감소된 신호 펩타이드 절단 형태로의 시간이 지남에 따라 GP120의 번역 후 신호 펩티드 골짜기를 나타낸다.
더 많은 단백질이 네이티브 접을 달성하고 그들의 신호 펩티드를 분실하기 때문에 추격 도중 증가하는 신호 펩티드의 손실 때문에 이동성이 증가합니다. 비 감소 및 감소 젤 모두에서, 신호는 GP120의 분비로 인해 약 1 시간 에서 감소하기 시작합니다. 미디어를 분석하여 모니터링할 수 있습니다.
이 방법은 오가노이드 세포 모델을 포함한 모든 세포주에도 적용됩니다. 그러나 성공은 크게 관심의 단백질의 발현 수준에 따라 달라집니다. 이 절차를 시작하기 전에, 당신의 요리를 표시하고 실험 을 통해이 순서를 유지합니다.
기아 매체를 추가하기 전에 모든 것이 준비되었는지 확인하십시오. 이것은 실험의 시작입니다. 그리고 당신의 실험실 시간은 당신의 친구이지만, 당신이 준비되지 않은 경우 가장 큰 적이 될 수 있습니다.
빌의 추적은 시간이 지남에 단백질의 전체 재산을 조사하기 위해 제한된 proteolysis와 결합 될 수있다. 또한 다른 선출 된 냉동고 방법은 헹구거나 엄격하거나 충전 차이의 분석을 허용합니다. 연구자와 장치를 보호하기 위해 모든 지역 방사선 안전 규칙을 준수해야 합니다.
그리고 보호 조치는 프로토콜에 따라 취해야한다. STH 페이지에 사용되는 아크릴아미드는 신경 독성이 있습니다.
