이 방법은 식물 틸라코이드 막에서 광합성 단백질 복합체의 조성 및 동적 조직에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 토착 단백질 복합체 간의 기능적 상호 작용을 분석할 수 있고 다양한 환경 조건에서 단백질 복합 조직의 가소성을 해명한다는 것입니다. 0.75밀리미터 스페이서를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 젤 캐스터 8센티미터를 10센티미터 플레이트로 설정합니다.
교반 판에 그라데이션 믹서를 놓고 튜브를 통해 연동 펌프와 연결합니다. 튜빙의 다른 쪽 끝에 주사기 바늘을 부착하고 유리와 알루미늄 플레이트 사이에 바늘을 놓습니다. 무거운 챔버에 자기 교반기를 놓습니다.
분리 젤 그라데이션에 사용하기 위해 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에 3.5% 및 12.5%의 아크릴아미드 솔루션을 준비한다. 적시에 중합을 방지하기 위해 용액을 준비하는 동안 원심 분리관을 얼음 위에 유지합니다. 그라데이션 믹서에 솔루션을 피펫하기 직전에 5%APS와 TEMED를 추가합니다.
파이펫 무거운 챔버에 12.5 %의 솔루션. 두 챔버를 연결하는 밸브를 열어 빛과 무거운 챔버를 연결하는 채널에서 기포를 제거하여 용액이 라이트 챔버에 들어갈 수 있도록 합니다. 밸브를 닫고 용액의 흔적을 무거운 챔버로 다시 닫습니다.
마지막으로, 3.5%의 용액을 광챔버에 파이펫으로 바합니다. 자기 교반기켜 보입니다. 밸브를 열고 연동 펌프를 켭타보틱 펌프를 켭타보합니다.
젤 솔루션이 분당 약 0.5 밀리리터의 유량으로 유리판과 알루미늄 플레이트 사이를 흐르도록 합니다. 바늘은 항상 액체 위에 있어야합니다. 무겁고 가벼운 챔버가 비워지면 초순수물로 채웁니다.
그리고 물이 젤 표면을 부드럽게 오버레이할 수 있도록 합니다. 젤 중합은 실온에서 약 1 ~ 2 시간이 걸립니다. 실온에서 스태킹 젤을 위한 3%아크릴아미드 용액을 준비합니다.
파이펫은 중합 분리 젤 위에 스태킹 젤을 하고 기포를 피하는 유리판과 알루미늄 판 사이에 샘플 젤 빗을 놓습니다. 실온에서 30~60분 동안 젤을 중합할 수 있게 한 후, 초순수 수중에서 빗을 부드럽게 제거합니다. 이 시점에서 젤은 며칠 동안 습한 조건에서 섭씨 4도 의 양수로 보관할 수 있습니다.
얼음 차가운 25BTH20G 버퍼로 격리된 틸라코이드를 밀리리터당 1밀리그램의 최종 엽록소 농도로 희석합니다. 각 틸라코이드 샘플에 대해 두 개의 튜브를 준비하여 베타-DM및 디지토닌 용윤화를 모두 수행합니다. 이제 동일한 양의 세제 버퍼를 추가합니다.
세제와 틸라코이드 샘플을 파이펫과 부드럽게 섞어 기포를 만들지 마십시오. 베타-DM 용해화를 위해 얼음 위에 2분 동안 틸라코이드를 용해시합니다. 또는 실온에서 10 분 동안 디지토닌 용해화를 위해 로커 또는 셰이커에 연속 부드러운 혼합이 있습니다.
인큐베이션에 따라, 양수 섭씨 4도에서 20분 동안 18, 000g에서 원심분리에 의한 불용성 물질을 제거한다. 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 상체를 옮기고 샘플에 1/10 볼륨의 쿠마시 브릴리언트 블루 버퍼를 추가합니다. 수직 전기 전광 시스템에 젤을 설정합니다.
상부 버퍼 챔버를 파란색 음극 버퍼로 채우고 하부 버퍼 챔버에 양극 버퍼를 붓습니다. 틸라코이드 샘플을 우물에 적재합니다. 전기 전도를 시작하고 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 전압을 점차적으로 증가시다.
차가운 방을 사용하거나 냉각 시스템으로 젤 온도를 조정하는 양수 섭씨 4도에서 젤을 실행합니다. 샘플 전면이 젤의 약 1/3을 마이그레이션할 때 파란색 음극 버퍼를 명확한 음극 버퍼로 변경합니다. 전기 전광 실행 후 이미지 보관을위한 사진 스캐너와 젤을 스캔합니다.
2-SDS PAGE를 수행하려면 1mm 스페이서를 사용하여 수직 전기 전도 시스템을 조립한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 2D 빗으로 표준 SDS 젤을 준비합니다. BN 젤에서 차선을 잘라 5 밀리리터 튜브에 놓습니다.
그런 다음 Laemmli 버퍼 2 밀리리터를 추가하고 실온에서 부드러운 흔들림으로 스트립을 45 분 동안 배양하십시오. 기포를 피하는 젤 위에 스페이서의 도움으로 차선을 놓습니다. 좁은 필터 용지에 분자량 마커 5마이크로리터를 피펫하여 종이를 표준에 잘 배치합니다.
BN 젤 스트립을 밀봉하고 마커 종이는 겔 스트립 위에 있는 완충제에 0.5%의 아가로즈를 부어 고화시킬 수 있도록 한다. 표준 프로토콜에 따라 전기 전도를 수행합니다. 전기 전광 실행 후 SUPRO 루비 얼룩 또는 은 얼룩으로 단백질을 시각화합니다.
베타-DM 및 디지오닌 용해성 샘플의 틸라코이드 단백질 복합 패턴의 대표적인 결과가 여기에 나와 있다. 작은 복합체는 전기 전구 실행 중에 더 빨리 이동하므로 겔의 하부에 있습니다. 큰 복합체는 젤의 상부에 있는 반면.
Digitonin은 일반적으로 더 큰 어셈블리에서 단백질 복합체를 보존하고 베타 DM은 복합체 간의 음순 단백질 단백질 상호 작용을 방해합니다. 베타-DM 및 디지오닌 용해성 틸라코이드의 단백질 복합체의 서브유닛 조성물은 여기에서 제시된다. 각 복합체의 하위 단위는 정렬된 복합체 아래의 수직 선에서 찾을 수 있습니다.
원칙적으로, 2-D 젤의 각 지점은 개별 단백질을 나타낸다. 그러나 실제로, 동일한 분자 질량의 몇몇 단백질은 단 하나 자리에 존재할 수 있습니다. 반점의 식별은 질량 분석 분석을 기반으로합니다.
이 절차를 적용한 후 단백질 복합체에 대한 구조적 통찰력을 얻기 위해 블루 네이티브 젤에서 출동된 단백질 복합체의 전자 현미경 검사법과 단일 입자 분석과 같은 다른 방법을 계속할 수 있다. 알 수 없는 단백질 하위 단위를 식별하기 위해 2차원 SDS PAGE에서 개별 단백질 반점을 질량 사양으로 분석할 수 있다. 아크릴아미드와 디지오닌을 사용하면 매우 해로울 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 보호 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.
