이 방법은 지질 막을 가진 단백질의 방향을 공부하는 것을 도울 수 있습니다. 우리의 경우, 부정적으로 충전 된 인지질에 부속의 칼슘 의존적 결합을 분석하는 데 사용합니다. 이 기술의 주요 장점은 라벨이 없고 민감하며 정량적이며 상호 작용을 실시간으로 관찰할 수 있다는 것입니다.
따라서 실제 결과의 직접 분석을 허용합니다. 이 기술은 또한 더 복잡한 소분자 어셈블리 또는 세포의 상호 작용과 같은 그밖 시스템에 적용될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 명확한 5밀리머 지질 솔루션을 사용합니다.
10 밀리리터 유리 튜브에 원하는 어금니 비율로 용존 지질을 결합합니다. 질소의 건조한 스트림을 사용하여 유기 용매를 증발시다. 용매의 잔류 흔적을 제거하기 위해 3 시간 동안 높은 진공 lyophilization 시스템에 지질 혼합물을 둡니다.
이제 지방 막을 1 밀리리터의 체산화 로 다시 일시 중단합니다. 수조에서 섭씨 60도에서 지질 현탁액을 30분간 배양하여 5분마다 활발하게 소용돌이를 입습니다. 이 온도는 혼합물에서 가장 높은 용융 지질의 위상 전이 온도보다 섭씨 약 10도입니다.
한편, 전이 온도보다 50나노미터 직경의 모공 크기의 폴리카보네이트 멤브레인을 장착한 압출기는 30분 동안 예열한다. 다일라멜라 소포 서스펜션을 예열된 압출기에 적재합니다. 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 혼합물을 31번 부드럽게 전달하여 작은 유니라멜라 소포 또는 SUV를 형성합니다.
온도가 전이 온도 보다 높게 유지됩니다. SUV 서스펜션을 2밀리리터 플라스틱 반응 용기로 옮기고 구연산 버퍼를 추가하여 최종 볼륨을 2밀리리터에 가져옵니다. 폴리테트라플루오로틸렌 홀더에 삽입된 4개의 센서를 2% SDS 솔루션에 30분 이상 배양합니다.
그런 다음 SDS를 완전히 제거하고 건조 아르곤 또는 질소의 스트림을 사용하여 시도하기 위해 초순수물로 광범위하게 세척하십시오. 플라즈마 세척 시스템을 사용하여 오염 물질을 완전히 제거하십시오. 이를 위해 플라즈마 세정실에 건조 센서를 삽입하고 챔버를 대피시키고 산소로 세 번 세척합니다.
그런 다음 플라즈마 클리너를 켭니다. 진공, 높은 무선 주파수 전력 및 10분의 공정 시간을 사용합니다. 청소 가 끝난 후 기계를 끄고 센서를 꺼낸다.
핀셋을 사용하여 플라즈마 청소 센서를 4개의 유량 챔버에 조심스럽게 도킹합니다. 누출을 일으킬 수 있는 챔버와 튜브의 압력이나 비틀림을 피하십시오. 열린 흐름 모드에서 구연산 버퍼로 시스템을 10분 동안 플러시합니다.
프로그램을 시작합니다. 주파수 및 소멸 기준선이 안정될 때까지 소프트웨어를 사용하여 첫 번째 기본 톤과 배음의 주파수 및 소멸의 변경 사항을 기록하십시오. 기준선이 안정되면 체연성 버퍼에 SUV 서스펜션을 적용합니다.
반응 용기를 사용하여 죽은 부피의 1.5 밀리리터를 제거한 다음 루프 흐름 모드에서 시스템을 닫습니다. 주파수 소멸 시프트를 10분 더 기록합니다. SLB가 안정되면 40분 동안 열린 유동 모드에서 필요한 칼슘 농도에서 실행 버퍼로 시스템을 평형화합니다.
칼슘을 함유한 러닝 버퍼에 단백질을 넣습니다. 평형 정상 상태에 도달할 때까지 루프 흐름 모드에서 단백질의 적용을 수행합니다. 이제, 오픈 유동 모드에서 실행 버퍼에 5 밀리모어 EGTA와 칼슘 이온을 킬로하여 결합 된 단백질을 해리.
연속 오픈 유동 모드에서 50밀리리터의 이중 증류수로 마이크로밸런스 시스템을 재생합니다. 물 용기에서 튜브를 제거하고 시스템이 건조하게 하십시오. 정결정 센서를 조심스럽게 제거하고 폴리테트라플루오로틸렌 홀더를 사용하여 2% SDS 용액으로 세척합니다.
센서가 배치된 유동 모듈 내부의 가시 부품을 건조시합니다. 여기에 도시된 주파수 곡선 및 소멸 시프트의 기록입니다. 리포솜을 첨가하면 주파수의 눈에 띄는 하락은 완충소포가 단단하지 않지만 점성성이 있기 때문에 흡수를 나타내며, 방출이 증가합니다.
그 후, 합착 소포파열. 소포 내부의 완충제의 수반되는 방출은 안정된 고원에 도달할 때까지 흡착 질량을 감소시다. 지질에 대한 부속서 A2의 결합은 명확한 주파수 변화에 의해 보이는 질량을 추가하지만, 소멸의 유일한 작은 변화에 의해 표시된 바와 같이 이중 층 구조를 방해하지 않는다.
칼슘 이온이 킬라팅 에이전트에 의해 제거되면, EGTA, 부속서 A2는 지질 필름에서 해리. 주파수및 소멸 기록은 부속서 A2 결합을 나타내는 이중층으로만 보이는 수준으로 이동하며 칼슘 이온에 완전히 의존하며 지질 필름은 그대로 유지됩니다. 대표적인 음성 제어 실험이 여기에 표시됩니다.
인산염이 없을 때, 칼슘 이온이 있는 경우, 부속서 A2를 첨가한 후에는 주파수 나 소멸의 변화가 뚜렷하지 않다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 이중 레이어 형성을 보장하는 것이 중요합니다. 리포솜을 즉시 사용하면 작은 소포가 표면 장력이 적어 불안정한 기준선으로 이어질 수 있는 더 큰 소포로 융합됩니다.
이 절차에 이어, 막 단백질 상호 작용에 대한 양자적 설명은 협동 대 비협조적 결합과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행될 수 있다.
