이 프로토콜은 연구원이 살 코로나바이러스 및 대부분의 코로나바이러스와 같은 고병원성 바이러스의 바이러스 성 진입 사건을 연구하는 데 안전하게 사용될 수 있는 의사형 바이러스를 생성할 수 있게 합니다. 이 다목적 기술은 쉬운 설정 과도 형 경피를 기반으로합니다. 이 시스템은 또한 코로나바이러스 S.뿐만 아니라 다른 바이러스의 융합 단백질로 의사형입자를 생성하기 위해 적용될 수 있으며, 최상의 결과를 얻으려면 가짜 바이러스 감염뿐만 아니라 형바이러스 감염에 대한 세포 건강과 밀도를 모니터링하는 것이 중요하다.
이 절차를 시연하는 것은 티파니 탕과 락슈미 네이선이 될 것입니다. 내 실험실에서 대학원생. 우선 HEK293T 세포를 섭씨 37도, 사전 데워진 DPBS 2회 10밀리리터로 조심스럽게 세척하십시오.
다음으로, 수퍼네티드를 흡인하고 섭씨 37도에서 미리 데워진 25%의 트립신 용액1밀리리터로 세포를 부착합니다. 보다, 세포의 플라스크를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 환경에서 세포가 분리되기 시작할 때까지 3~5분간 배양한다. 트립신 솔루션을 비활성화하려면 4밀리리터의 완전한 DMEM을 추가합니다.
그런 다음 셀 카운팅 슬라이드와 가벼운 현미경을 사용하여 세포를 계산합니다. 완전한 DMEM을 사용하여 밀리리터당 500, 000 세포로 세포를 희석시하십시오. 다음으로, 6웰 조직 배양 플레이트에서 세포 용액의 웰당 2밀리리터를 시드한다.
그리고 부드럽게 접시를 앞뒤로 좌우로 움직이면 셀을 고르게 분배합니다. 세포가 균등하게 분포되어 있는지 확인한 후 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 환경 5%로 하룻밤 사이에 또는 16~18시간으로 배양한다. 3개의 플라스미드 응전을 제거하기 위하여는, 마이크로 원심분리기 관에서 플라스미드의 계산된 양및 감소된 혈청 세포 배양 배지를 먼저 혼합한다.
5 분 동안 실온에서 혼합물을 배양. 그런 다음 지질 계 의 혈청 세포 배양 배지의 웰 당 47 마이크로 리터에 지질 기반 의 성전환 시약당 3 개의 마이크로 리터를 추가합니다. 5 분 동안 실온에서 혼합물을 배양.
다음으로, 마이크로 원심분리기 튜브에서, 파이프를 여러 번 위아래로 향하고 에 의해 형질 시약과 플라스미드 솔루션의 동일한 금액을 혼합. 20 분 동안 실온에서 혼합물을 배양. 세포 판의 하룻밤 잠복 후, 그들의 형태와 밀도에 대 한 세포를 검사 하는 반전 된 빛 현미경을 사용 하 여.
이어서, 소비된 세포 배지를 흡기하고, 미리 따뜻해지는 혈청 세포 배양 배지의 웰당 1밀리리터를 각각 양호에 부드럽게 첨가한다. 다음으로, 각 웰 드롭 현명한 각 에 100 마이크로 리터의 형질 화질을 추가합니다. 그리고 4 ~6 시간 동안 5 %의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
인큐베이션의 끝에서, 각 우물에 섭씨 37도에서 미리 따뜻하게 항생제 무료 경피 DMEM의 1 밀리리터를 추가합니다. 그리고 48 시간 동안 5 %의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 의사형 입자 수집을 시작하려면 반전된 광 현미경을 사용하여 형태와 일반적인 상태에 대한 세포를 시험합니다.
매체의 색상은 밝은 분홍색 또는 약간 주황색이어야합니다. 그런 다음, 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 전감염된 세포의 슈퍼나티를 전송한다. 튜브를 290배 의 중력으로 7분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거합니다.
다음으로, 필터는 멸균 0.45 미크론 모공 크기 필터를 통해 상피성정제를 명확히 했다. 저온 바이알에서 의사형 바이러스 용액의 소량 알리쿼트를 만듭니다. 그리고 음의 섭씨 80도에 보관하십시오.
의사형 입자 감염을 수행하기 위해, 세포의 수렴 카펫이 있는지 확인하기 위해 가벼운 현미경의 밑에 첫번째 시험 세포. 그런 다음, 37섭씨에서 미리 따뜻해진 DPBS의 0.5 밀리리터로 세포를 세 번 씻는다. 다음으로, 세포의 초중자를 흡인시키고 해동된 의사형 입자 용액의 200 마이크로리터로 세포를 접종한다.
1~2시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도의 세포를 배양합니다. 인큐베이션 기간 이후에는 섭씨 37도에 미리 따뜻해지는 DMEMc의 마이크로리터 300마이크로리터를 추가합니다. 그리고 감염된 세포를 섭씨 37도에서 72시간 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다.
마지막으로 감염된 세포의 슈퍼나츠를 흡인시합니다. 그리고 루시파라제 기자 분석에 앞서. 의사형 입자의 감염성을 정량화하기 위해 먼저 영하 80도에서 저장되는 루시퍼린 기판은 5시에 영하 20도에서 실온까지 저장된다.
그런 다음 루시파라제 분석 분석 리시스 버퍼를 멸균물로 1배 농도로 희석합니다. 다음으로 각 웰에 희석된 버퍼의 마이크로리터 100개를 추가합니다. 그리고 15 분 동안 로커에 실온에서 배양.
루시파라제 활동 측정을 수행하기 위해, 한 번에 하나씩, 먼저 마이크로 원심분리기 튜브에 루시퍼린 기판 20 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브에 lysate의 마이크로리터 10을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 가볍게 쓸어서 내용내용을 섞는다.
그리고 발광계 장치에 튜브를 배치. 뚜껑을 닫고 튜브의 발광 값을 측정합니다. 상대 광 단위 측정을 기록하고 데이터 분석 앞에 기록합니다.
SARS-Spp와 MERS-Spp의 감염성 분석은 취약한 숙주 세포에서, 예상된 긍정적인 대조군 입자에 비해 강한 평균 감염성을 보였다. 바이러스 봉투 당단백질이 결여된 비감염 된 대조군 및 부정적인 대조 입자. 또한 루시파라제 활성 아사제는 SARS-Spp와 MERS-Spp 감염의 농도 의존성을 보였다.
SARS-Spp 또는 MERS-Spp 감염의 증가는 SARS-Spp의 ACE2 수용체, 또는 MERS-Spp의 DPP4 수용체를 발현하기 위해 감염된, 의사 비리온의 수용체 사용이 가짜 비리온의 부착 및 입력을 중재하기 위한 나토 바이러스의 것과 유사하다는 것을 확인합니다. 이 단계를 수행하기 전에 계산을 다시 확인합니다. 또한 단계 중에 모든 솔루션이 잘 혼합되어 있는지 확인합니다.
서쪽 블롯 분석체는 S 당단백질이 의사비리온으로 통합된 것을 평가하기 위해 집중된 의사형 입자에서 수행될 수 있다. 여기에 설명된 의사 형 입자는 nato 바이러스보다 더 안전한 대리이지만 여전히 생물 안전 수준 2 가지 예방 조치가 필요합니다.
