이 프로토콜에서, 동일한 숙주에서 2개의 항체는 숙주 세포 및 병원체 상호 작용을 연구하기 위하여 면역 형광 분석에서 함께 이용될 수 있다. 기생충에 있는 특정 세포 구조 및 단백질을 인식하기 위하여 유효한 몇몇 상업적인 항체가 있기 때문에, 이 프로토콜은 아주 유용할 수 있습니다. 이것은 동일한 종에서 제기된 다각성 및 단일 클론 항체를 사용하는 이중 라벨링 면역 형광 프로토콜입니다.
많은 연구원은 이것이 가능하다는 것을 인식하지 못할 지도 모릅니다. 이 접근법은 항체의 근원이 제한될 때 돕습니다. 감염된 숙주 세포에서 숙주 세포 단백질에서 병원균을 검출하는 데 사용할 수 있으며 자유로운 살아있는 유기체에도 적용될 수 있다.
이것은 간단한 프로토콜이며, 항체의 첫 번째 와 두 번째 쌍 사이의 하나의 차단 단계를 필요로한다. 절차는 박사 카밀라 Gachet-카스트로와 박사 과정 학생 레이스 Trajano-Silva 내 실험실에서 시연 될 것이다. Trypanosoma cruzi로 LLC-MK2 세포를 감염한 지 3일 후, 15 밀리리터 세포 배양 원컬 튜브에서 감염된 세포로부터 상류체를 수집한다.
원심 분리는 세포 파편을 낮추기 위해 샘플을 한심분리한 다음, 시험포마스티고가 상체로 수영할 수 있도록 튜브를 실온에 놓습니다. 10 분 후, 새로운 원적 튜브에서 상체를 수집 한 다음 샘플을 원심 분리하고 완전한 RPMI 매체에서 기생충을 포함하는 펠릿을 다시 중단하기 전에 상체를 폐기하십시오. UV 살균 둥근 커버립을 포함하는 24웰 플레이트에 LLC-MK2 셀을 추가하고 16시간 동안 정착할 수 있도록 합니다.
그런 다음 세포를 감염시키기 위해 T.Cruzi를 포함하는 상체를 각 우물에 추가하고 6 시간 동안 배양하십시오. 다음으로, 감염된 세포와 비감염세포를 PBS로 5회 세척한 다음 PBS에서 2%의 파라포름알데히드로 세포를 수정합니다. 10분 후 PBS로 5분 동안 커버립을 세 번 씻은 다음 이온이온세제로 커버립을 10분 간 세척합니다.
3개의 5분 PBS 세차재 후에, 30분 동안 블로킹 용액에 있는 커버립을 배양하고, 마우스 단클론 또는 폴리클론 항체로 또 다른 30분 배양이 뒤따릅니다. PBS 세차 후, 커버립을 차단용액과 프할로이드신을 차단하는 보조 항체로 30분 동안 배양하여 숙주 셀에서 액틴 필라멘트를 얼룩지게 한다. 그런 다음 슬라이드 표면에 DAPI 배지로 소량의 페이드 장착 시약을 적용하기 전에 PBS로 커버립을 세 번 다시 세척합니다.
집게를 사용하여, 부드럽게 거품 형성을 방지하기 위해 매체에 커버 슬립을 기울. 이중 라벨링의 경우, 이전에 입증된 바와 같이 블로킹 용액에서 커버립을 배양한 후 마우스 폴리클론 항체에서 30분 동안 배양한다. 다음으로, 커버립을 PBS로 5분 동안 3회 세척한 후 이차 항체로 30분 간 배양합니다.
그런 다음 세 개의 PBS 세차재에 따라, 차단 용액에서 희석 된 AffiniPure 토끼 안티 마우스 IgG와 함께 두 번째 차단 단계를 수행합니다. 30분 후, 마우스 단일 클론 항체로 30분 간 배양하기 전에 PBS로 커버립을 다시 세척합니다. 다음으로, 세 개의 PBS 세차재 후 염소 안티 마우스 IgG 2B 항체 및 판로이드로 커버립을 배양합니다.
그런 다음 세 가지 PBS 세차재에 따라 이전에 설명한 대로 페이드 방지 장착 시약을 적용합니다. 트리플 라벨링을 위해, 마우스 폴리클론 항체로 커버립을 차단하고 인큐베이팅한 후 염소 항마우스 항체를 거쳐 30분 동안 차단용액에 토끼 폴리클론 항체로 새로운 인큐베이션을 시작한다. 그런 다음 3개의 PBS 세차체 후에, 염소 항토끼 항체로 커버립을 30분 동안 배양한다.
다음으로, 3개의 PBS 세차재에 이어, 30분 동안 차단용액에 희석된 AffiniPure 토끼 항마우스 항체로 블로킹 단계를 수행한다. 그런 다음 마우스 모노클론 IgG 서브 클래스 항체로 30 분 동안 배양하기 전에 커버립을 다시 씻으십시오. 3개의 PBS 세차체에 따라, 염소 안티 마우스 IgG 하위 클래스 항체의 특정 쌍으로 30 분 동안 커버립을 배양한다.
인큐베이션 후 PBS로 5분 동안 커버립을 세 번 씻습니다. 63X 오일 침지 목표를 가진 공초점 현미경을 사용하여 면역 형광성 샘플을 분석하고 광증 튜브 및 하이브리드 검출기로 형광을 감지합니다. 그런 다음 분리 된 채널로 모든 공초점 이미지를 획득하고 Adobe Photoshop을 사용하여 이미지 처리를 수행합니다.
이러한 공초점 현미경 이미지는 숙주 세포 및 내재화된 기생충에서 항체의 특이성을 강조하는 감염및 비감염 세포의 대조 실험결과를 보여준다. 마우스 폴리클론 항체 항-Trypanosoma cruzi FAZ는 기생충 깃발의 깃개 부착 영역에서 T.cruzi 거대 단백질을 인식했지만 숙주 세포에서는 그렇지 않았습니다. 핵에 있는 이질적인 핵 리보뉴클레오프로틴 A1의 분포는 숙주 포유류 세포만을 인식하는 상업적마우스 단클론 항체를 사용하여 관찰되었지만 기생충은 아니다.
또한, 숙주 및 기생충 핵 및 기생충 운동성 세포는 DAPI로 염색되었고 호스트 F-actin은 알렉사(594)에 컨쥬게이트된 프할로이드진으로 염색되어 항체의 특이성을 확인시켰다. 이중 라벨링 면역 형광은 공초점 현미경 검사법에 의해 분석된 숙주 및 기생충에 있는 단백질 분포를 보여줍니다. 라벨링은 이 방법론을 사용하여 항체 간의 교차 반응을 제안하지 않았다.
요약하자면, 호스트 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 여기에 설명된 프로토콜은 항체의 어떤 조합에도 적응할 수 있는 기본적이고 정교한 기술을 제시합니다. 이 접근법은 면역 형광 비용을 효과적이게 하고 몇몇 항체가 유효할 때 관심있는 2개 이상의 단백질의 현지화를 연구하는 것을 도울 수 있습니다.
