이 연구에서는 Bat MHC Class I를 모델로 사용하여 방법론을 요약하고 이종성 베타-2 마이크로글로불린으로 복잡한 하이브리드 MHC 클래스의 타당성을 평가했습니다. 이전 연구는 포유류 B2M 대체펩티드 프리젠 테이션에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 사실, 하이브리드 MHC 클래스 는 본래 분자와 유사한 구조및 기능을 활성화할 수 있다.
이러한 기술은 전염병 및 종양 면역 요법 동안 조직 반응 평가를 위해 MHC I의 기능및 구조화 연구를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 대장균 배양 변환을 위해 박쥐 또는 인간 MHC 클래스를 함유하는 플라스미드 10 나노그램을 100 마이크로글로불린 수소 사슬을 100 마이크로리터에 베타하고 30분 동안 얼음에서 현탁액을 목욕시킵니다. 인큐베이션이 끝나면 박테리아를 섭씨 42도에서 90초 동안 열충격을 주어 2분간 얼음 욕조로 문화를 되돌려 보겠습니다.
다음으로 800 마이크로리터의 리소제니 국물을 문화에 추가하고, 섭씨 37도에서 20분 동안 흔들 플랫폼에서 서스펜션을 흔들고 분당 200회 회전합니다. 인큐베이션이 끝나면 박테리아의 100 마이크로리터를 적절한 항생제 내성 배양 블레이드에 퍼뜨리게 됩니다. 다음 날 아침, 최근에 변형된 단일 세균 클론을 선택하고 항생제 배지를 가진 LB의 3밀리리터로 클론을 접종합니다.
12~16시간 동안 37도의 흔들림 을 위해 흔들 기위에 문화를 놓습니다. 다음 아침, 활성 세균성 스톡 의 500 마이크로리터를 항생제 배지로 LB의 50 밀리리터로 옮기고 박테리아를 하룻밤 동안 흔들 인큐베이터로 돌려보라고 한다. 나머지 활성 세균 성 육수를 500 마이크로 리터 알리쿼트로 나누고 각 알리코트를 섭씨 80도 저장에 대해 40 % 글리세롤의 500 마이크로 리터 볼륨에 추가합니다.
다량의 재조합 단백질을 생성하기 위해, 다음날 아침 세균현탁액을 항생제 배지를 1 내지 100 비율로 LB 2리터로 옮기고, 600나노미터에서 0.6의 흡광도가 달성될 때까지 배양을 흔들 인큐베이터로 되돌려 한다. 이어서, 트랜스 유전자의 발현을 유도하기 위해 배양에 1밀리머 IPTG를 첨가한다. 4~6시간의 유도 후, 세균 배양을 원심분리용 병으로 옮기고, 병당 PBS의 60밀리리터에서 세균세포 펠릿을 다시 중단한다.
그런 다음 초음파 세포 파괴기99회, 초음파당 300와트에서 12초 간격으로 발현된 재조합 단백질을 99회 해방한다. 포함 된 신체 정화에 대 한 원심 분리에 의해 초음파 박테리아를 수집 하 고 두 개의 추가 원심 분리에 대 한 세척 버퍼의 적절 한 볼륨에서 펠 릿을 다시 중단. 두 번째 세척 후 포함 바디 및 재서스펜션 버퍼를 다시 중단하고, SDS 페이지에 대한 샘플의 20 마이크로리터 알리쿼트를 따로 떼어 내어 포함 체순도를 테스트한다.
나머지 샘플을 원심분리하고 펠릿을 포함하는 포함 체의 무게를 측정합니다. 버퍼밀리리터당 30밀리그램의 포함 체에 펠릿에 용해 버퍼를 추가합니다. 그리고 자기 교반기를 사용하여 용액을 섭씨 4도에서 천천히 저어주며, 포함 된 몸이 용해 버퍼에 용해 될 때까지.
침전을 버린 후 포함 된 몸을 영하 20도 또는 영하 80도로 저장하십시오. MHC 복합재폴딩의 경우, 글루타티온 5밀리머감소글루타티온과 0.5 밀리머 산화 글루타티온을 250~300밀리리터에 추가하면 섭씨 4도의 재폴딩 버퍼를 넣습니다. 그리고 10~20분 동안 4°C에서 자기 교반기에서 용액을 천천히 저어줍니다.
MHC 수소 체인 및 베타 2개의 마이크로글로불린 희석의 경우, 포함 체를 1밀리리터 주사기에 적재하고 포함 체액 의 1리터 부피를 교반 바 근처의 재접이식 버퍼 1리터에 주입하여 빠르고 효율적인 희석을 얻습니다. 다음으로, 디메틸 설프산화물에 펩티드 밀리리터 당 5 밀리그램을 용해하고, 방금 입증된 바와 같이 200마이크로리터의 펩티드를 재빨리 재보딩 용액에 주입한다. 10-20분간의 느린 교반 후, H 체인 포함 바디 3밀리리터를 새로운 1리터 의 재접이식 버퍼에 주입하고 8~10시간 동안 섭씨 4도에서 재폴딩을 진행할 수 있도록 합니다.
재접힌 단백질 농도를 결정하기 위해 10킬로달톤 다중 구리 산화막으로 가압 챔버에 교환 버퍼를 추가하고 완충액을 30~50밀리리터 부피로 농축한다. 재접이식 용액을 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리에 의한 침전액을 제거한다. 슈퍼네이트를 조심스럽게 챔버로 옮기고 버퍼를 약 1 밀리리터의 최종 부피로 농축합니다.
원심분리에 의해 최종 오염 물질을 제거하고 슈퍼네이트를 멸균 튜브로 옮긴다. 10300개의 GL 크기 배제 컬럼을 사용하여 단백질을 정화하고, 피크시 샘플을 수집하고, SDS 페이지를 사용하여 분석합니다. MHC 복합 피크를 수집하고 밀리리터 당 15 밀리그램의 최종 농도로 단백질을 농축합니다.
그런 다음 복합체를 밀리리터 농도당 7.5 밀리그램으로 희석합니다. 착석 낙하 증기 확산 기술을 사용하여 복잡한 MHC 및 펩타이드의 결정화를 수행하기 위해, 시료의 0.8 마이크로리터를 상업용 결정보드에 추가하고 보드를 밀봉한다. 4또는 18도에서 100 마이크로리터의 저수지 용액에 대한 샘플 용액을 상화하고 현미경을 사용하여 향후 6개월 동안 의정 성장을 정기적으로 관찰합니다.
극저온 보호를 위해, 실험의 끝에서, 100도 켈빈 기체 질소 스트림에서 시료를 빠르게 냉각하기 전에 20% 글리세롤을 포함하는 저장 용액으로 결정을 전송합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 x선 회절 데이터를 수집합니다. 결정 복합체의 구조를 결정하기 위해 HK L 2000 소프트웨어 패키지 내에서 Denzo 프로그램에서 고해상도 구조 X선 회절 데이터를 열고 단백질 데이터 뱅크에서 초기 모델을 선택합니다.
단백질의 구조를 결정하기 위해 CCP4의 Phaser MR 프로그램에서 데이터를 열고 초기 관절 정제를 위해 정제된 X-ray 모델을 사용합니다. 그런 다음 X선 단독으로 미세 조정을 위해 피닉스 세련미와 조인트 모드를 사용하며, X선 세련미를 위해 조인트 중성자를 사용합니다. 각 라운드의 개선 후, 수동으로 Fo-Fc에 대한 모델을 확인하고, 쿠트의 2Fo-Fc 긍정적 인 핵 밀도지도.
이러한 대표적인 실험에서, 헨드라 바이러스 유래 헨드라 바이러스 1 펩타이드의 결합 능력은 동종 박쥐 베타 2개의 마이크로글로불린 및 이종성 인간 베타 2개의 마이크로글로불린을 가진 MHC 클래스 I 수소 사슬을 박쥐로 펩티드하였다. 두 분석 모두, 고해상도를 가진 결정은 베타 2개의 마이크로글로불린 광사슬을 가진 레나튜레이션을 통해 형성되었다. 베타 2개의 마이크로글로불린이 없는 경우, 이러한 복합체는 형성되지 않는다.
MHC 클래스 I 수소 사슬 헨드라 바이러스 1, 인간 베타 2 마이크로글로불린 구조에서, 배트 베타 2마이크로글로불린에 해당하는 인간 베타 2개의 마이크로글로불린의 H31, D53, W60 및 Y63의 보존잔류는 펩타이드 결합 홈의 바닥과 접촉하고 Q8, Y10, R12 및 24잔류를 보존하여 베타 2마이크로글로불에 결합된 3개의 마이크로글로불에 해당한다. 전체 박쥐와 인간 구조물에서, 수소 사슬의 1~184잔류의 평균 루트 평균 제곱유도는 탄소 알파 원자의 모든 중첩하에서 0.248이며, 이는 이 두 복합체 사이에 차이가 없음을 나타낸다. 펩티드 정렬의 구조는 이 두 복합체에서 헨드라 바이러스 하나의 펩티드의 확인이 매우 유사하다는 것을 보여줍니다.
서열 정렬은 또한 다른 종에서 베타 2 마이크로 글로불린의 아미노산이 높게 보존된다는 것을 보여줍니다. 높은 보고 효율을 가진 적대단지를 제공하는 것이 중요합니다. 따라서 적합한 베타 2 마이크로 글로불린을 선택하고 고도로 정제된 포함 바디를 사용하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜은 다른 종에서 잠재적 인 베타 2 마이크로 글로불린 대체를 통해 복잡한 안정적인 MTC I를 획득하는 데 사용할 수 있으며, 존재하기 위해 MTC I 구조 및 기능입니다. 이러한 연구에서 얻은 데이터는 전염병 및 종양 면역 요법 중 T 세포 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
