스케일링은 개발 시스템의 보편적이고 근본적인 속성 중 하나이지만, 기본 메커니즘은 많은 장기와 조직에서 이해되지 않았습니다. 이 비디오에 제시된 Zebrafish의 크기 감소 기술은 동적 스케일링 프로세스의 기본 메커니즘에 대한 이해를 향상시길 것입니다. Zebrafish와 함께 작업의 장점은 라이브 이미징, 유전학 및 정량 분석을 수행하기 쉽다는 것입니다.
우리의 기술은 또한 어떤 전문 장비 또는 집중적 인 교육없이 적용하기 쉽습니다 매우 간단하고 쉽게. 배아의 건강은 이 기술로 성공의 열쇠입니다. 어린 물고기를 부모로 사용하고 축화를 제거하여 손상을 최소화하십시오.
또한 노른자에 상처의 크기와 얼마나 많은 세포가 제거되는지 놀수 있습니다. 우리가 사용하는 배아는 매우 젊고 깨지기 쉽기 때문에 옮기고 자르는 경우 매우 신중하게 처리해야합니다. 동시에 프로시저를 적시에 수행할 수 있도록 빠르야 합니다.
시각적 데모는 작은 배아를 효과적으로 생성하는 방법에 대한 좋은 감각을 줄 수 있습니다. 배아 자르기용 와이어 루프를 만들려면 유리 모세관을 통해 20센티미터 길이의 뻣뻣하고 비부식성 스테인리스 스틸 와이어를 공급하여 상단에 1mm 길이의 작은 루프를 만듭니다. 모세관과 와이어 루프 사이에 명확한 매니큐어의 작은 방울을 제자리에 고정시키고 배아를 손상시킬 수 있으므로 루프 부분에 매니큐어를 얻지 않도록하십시오.
그리고 건조하자. 실험실 테이프를 사용하여 유리 모세관을 나무 젓가락에 부착하여 젓가락 너머로 확장되는 유리 모세관의 약 2센티미터 반센티미터를 남기고 공구의 젓가락 부분이 나중에 물에 담그지 않도록 하십시오. 플라스틱 주걱이 있는 100mm 유리 페트리 접시에서 약 0.5밀리리터의 2%메틸 셀룰로오스를 바닥 중앙 부근에 얇게, 균등하게 약 0.5밀리미터 두께로 퍼뜨리었다.
링거의 용액약 약 30밀리리터를 접시 측면에 붓고 나머지 요리에 퍼지고 메틸 셀룰로오스를 덮습니다. 이전에 256세포에 있는 제분산화된 배아를 2%메틸 셀룰로오스에 1개의 K 세포 단계에 놓고, 배아가 그들의 편으로 지향되는지 확인하십시오. 블라발라를 자르려면 와이어 루프를 사용하여 동물 극 근처에서 동물 성축에 수직으로 자르고 약 30 ~40 %의 blastoderm 세포를 잘라냅니다.
그런 다음 끝을 부드럽게 탭하여 나머지 셀이 다시 달라붙도록 돕습니다. 노른자의 경우, 장착 된 와이어를 사용하여 달걀 막을 닉핑하여 식물장 근처의 작은 상처를 만들어 노른자가 몇 분 동안 스며 나온 다음 치유합니다. 노른자가 스며드는 것을 멈추면 파이펫을 사용하여 회복을 위해 같은 접시에 있는 메틸 셀룰로오스 외부의 배아를 이동시십시오.
모든 배아를 위해 블래술라와 노른자를 자르는 다음 배아가 회복되는 동안 30 분 동안 방해받지 않고 접시를 둡니다. 그런 다음, 유리 파이펫을 사용하여 신선한 1/3 링거 용액을 함유한 이전에 준비된 35mm 유리 접시에 배아를 옮기고 28.5도의 섭씨 인큐베이터에 배치하여 이미징을 계속하기 전에 완전한 회복을 허용합니다. 블라발라와 노른자를 잘라 두 단계를 수행 한 후, 배아는 대조군 배아에 비해 발달 단계 전반에 걸쳐 겉보기에 정상 전체 형태를 보였다, 크기 차이 이외의.
다른 한편으로는, blastula 전용 다진 태아는 특히 초기 단계에서 특이한 형태를 보여주었습니다. 상피하는 동안, 배아는 수축되고 들여쓰기모양이 있었다. 다음 소미트 단계에서, 중간 선 구조는 많은 축 수준에서 평평해진 것으로 나타났습니다.
나중에, 노른자에 인접한 바디 구조물은, 중간 및 힌드뇌와 같은 아직도 상대적으로 평평한 모양을 보여주었습니다, 아마도 상대적으로 더 큰 노른자에서 증가한 긴장 때문에. 솜무 형성의 시간 경과 화상 진찰은 통제와 다진 태아 둘 다에서, 나중에 단계에서 형성된 somites의 크기는 초기 단계에서 그들에 비해 더 작다는 것을 보여주었습니다. 또한, 소미트 형성 단계 전반에 걸쳐, 다진 배아는 대조군 배아에 있는 그들 보다는 더 작은 소미트가 있었습니다.
멤브레인 mCherry 주입 배아에서 2단계 도마 기술이 수행되었을 때, 20시간 후 수정후 척수의 이미징은 크기 감소로 인한 신경관 높이의 감소를 보였다. 2단계 자르기는 고효율의 작지만 정상적인 배아를 얻는 것이 매우 중요합니다. 블라술라에서 세포를 자르면서 노른자를 자르지 않는 것이 중요합니다.
노른자의 경우 내용이 스며들수 있도록 작은 상처를 입습니다. 그리고 노른자 막은 적절한 버퍼에서 자연적으로 치유됩니다. 다진 배아를 신속하게 회수할 수 있기 때문에, 임의의 방법또는 분석은 크기 감소 방법에 따라 정상적인 배아에 적용될 수 있다.
이 기술의 단순성과 다양성은 누구나 제브라피시의 조직이나 장기에서 스케일링 문제를 연구하는 이 기술을 도입할 수 있기 때문에 매우 강력합니다. 우리는 이 기술로 연구원들이 이전에 는 손길이 닿지 않은 다양한 시스템에서 스케일링 문제를 해결할 수 있다고 믿습니다. 우리는 이미 소미트와 신경관 패터닝의 스케일링에 중요한 발견을 했습니다.
