Name: a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
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우리는 비판적으로 원고 읽기 위한 박사 제시카 Habashi 감사 합니다. 우리 DR5 GFP 분석 결과의 지역화를 수행 하기 위한 이미징 센터,의 생명 과학, 수도 사범 대학 (베이징, 중국), 대학 박사 Xianyong Sheng을 감사 합니다. 이 작품은 베이징 시 정부 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (CIT &#38; TCD20150102) 국가 자연 과학 재단의 중국 (31600248)에서.

참고:이 프로토콜은 세 부분: 1) DIC 현미경;를 사용 하 여 야생-타입 애기 배아에서 패턴 형성 관찰 2) 특성화는 배아 패턴 형성을 통해 마커 단백질 표정 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법;를 사용 하 여 관찰 그리고 3) embryogenesis (예를 들어 naa10 돌연변이 사용)에서 특정 유전자의 역할을 결정.
1. 난 개간
<ol>
	<li>식물 소재 준비 참고: 여기에 설명 된 프로토콜; 건강 한 식물을 성장 하는 방법에 예입니다. 건강 한 식물을 성장 하는 다른 방법 또한 작동 합니다.<ol>
		<li>1.5 mL 튜브에 100 씨앗을 추가 하 고 소독 하 5 분 반전에 대 한 씨앗 튜브 여러 번 씨와 솔루션은 완전히 표면 씨앗 소독을 잘 혼합 되도록 1.5% 염소 (믹스 물 85 mL와 10% 염소의 15 mL)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>30에 대 한 원심 분리 하 여 튜브의 하단에 씨앗을 강제로 s 1200 x g에서 상쾌한, 제거 하 고 잔류 염소를 제거 하는 벤치에서 씨앗 살 균 물으로 4 번 세척.</li>
		<li>1 l의 초순 4.4 g Skoog (MS)와 村 重 기저 소금 혼합물의 고 자당의 10 g를 추가 합니다. 소금 및 자당 분해 혼합물을 저 어. 고 에이전트, Phytagel, 등의 3 세대 MS 자당 솔루션에 추가 1 m 코, pH 5.8에 솔루션을 조정 하 고 MS 매체를 15 분 동안 121 ° C에서 솔루션을 소독.</li>
		<li>MS 중간 접시를 생성 하는 12 cm 문화 요리에 MS 매체의 30 mL를 붓으십시오.</li>
		<li>MS 판에 소독된 씨앗을 놓습니다. 성장 챔버에 접시를 전송 하 고 씨앗 층 리 (어둠 속에서 4 ° C에서 3 일) 후 긴 하루 조건 (22 ° C 16 h는 빛과 어둠 속에서 8 h 동안 18 ° C)에서 접시를 유지.</li>
		<li>8 일 후의 성장, 식물 토양 (혼합 영양이 풍부한 토양 및 1:1 비율로 vermiculite) 쟁반에 전송 하 고 물 손실을 방지 하기 위해 5 일 흰색, 투명 한 뚜껑 트레이 커버 식물의 vitrification를 피하기 위해 간격을 두고.</li>
		<li>용지함에서 뚜껑 하 고 긴 하루 조건 (1.1.5 참조)에서 도보 약 실에 있는 식물을 육성. 오전 6 시 빛을 전환 하 고에서 오후 10 시. 대형 챔버에 성장의 약 20 일 후 식물은 꽃 있고 siliques 생산.</li>
		<li>씨앗의 위치에서 스레드가 있는 꽃 봉 오리는 꽃이 핌에서 오후 8 시 줄기 마크 (세 번째 꽃 봉 오리를 첫 번째 사용 하지 않는, 보통이 꽃 봉 오리에서 생성 된 siliques 몇 중단된 씨앗, 개발과이 비정상적인 ovules 정상의 비율을 변경할 수 있습니다). 표시 된 버드 오전 8 시 다음 날 아침 꽃 열 때로 난의 수 분의 시작을 정의 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoyer의 솔루션의 준비
	<ol>
		<li>50 mL 튜브에 chloral 하이드 레이트의 24 g을 추가 하 고 완전히 알루미늄 호 일 (chloral 하이드 레이트의 솔루션은 빛 아래에서 안정)와 함께 튜브 포장.</li>
		<li>다음, 위의 솔루션을 9 mL 초순 물과 글리세롤의 3 mL를 추가 하 고 해산 chloral 하이드 레이트 튜브를 흔들어. Hoyer의 솔루션으로 만들기 위해 모든 거품을 제거 하기 위해 실내 온도에 밤새 서 튜브를 하자.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>난 분리 및 정리
	<ol>
		<li>양면 접착 테이프의 조각을 현미경 유리 슬라이드에 연결 합니다. 원하는 수 분 (DAP) pseudoseptum; 표면에 수직으로 슬라이드에 후 일 수에 대 한 성장 하는 silique 배치 이것은 carpels (그림 1A 및 1B)를 쉽게 할 것 이다.</li>
		<li>주사기 바늘으로는 pseudoseptum의 양쪽에 carpels를 분할 하 고 2 개의 해 부 carpels 슬라이드 연결 하는 silique에서 ovules (그림 1C 및 1d) stereoscope 아래 볼 수 있습니다.</li>
		<li>유리 슬라이드에 Hoyer의 솔루션의 70 µ L를 분배 하 고 파 버 Hoyer의 솔루션으로 뾰족한 핀셋의 쌍의 끝을 축. stereoscope를 사용 하 여 이동은 ovules Hoyer의 솔루션으로 슬라이드에 배아를 청소를 핀셋으로. 부드럽게 모든 거품을 생성 하지 않으려면 슬라이드는 coverslip을 적용 됩니다.</li>
		<li>둔다 2-12 h에 대 한 어두운 방에 상자에 완성 된 슬라이드를 (더 성숙 된 난, 더 많은 시간이 필요 하 게 됩니다) 실내 온도에. 2/4-셀 단계 (1-2 DAP)에서 배아 배아 octant 구형 초기 (3 DAP) 사이 4 h 후 관찰 될 수 있다 그러나 2 시간 후 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 더 성숙한 배아 (4-8 DAP) 12 h 후 관찰할 수 있습니다.</li>
		<li>현미경의 DIC 함수를 사용 하 여 지운된 ovules를 검사 합니다. 저전력 필드 (10 배)에서 배아를 찾아서 다음 개발 된 배아에서 세포 패턴을 관찰 하 고 전력 분야 (100 X 기름 침수 렌즈)로 변경 합니다.</li>
		<li>다른 발달 단계에서 배아를 검사 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 배아 패턴화 및 마커 단백질 식의 관찰을 통해 셀 Id의 특성
<ol>
	<li>식물 재료의 준비
	<ol>
		<li>발기인 및 코딩 시퀀스 마커 유전자 또는 호르몬 응답 요소를 복제 하 고 형광 단백질 ( GFP); 같은 퓨즈 다음 구문이 삽입 (예: pCambia1300) 이진 벡터. 여기, auxin 응답 요소 DR5 예제10으로 제공 됩니다.</li>
		<li>Agrobacterium tumefaciens에 의해 야생 형 식물으로 결과 DR5 GFP 플라스 미드를 소개-변환11중재. T1 식물 hygromycin 포함 된 MS 중간 접시를 사용 하 여 선택 (50 mg/mL의 어머니 주류, 희석 1:1, 000). 유전자 변형 식물 긴 뿌리를 전시 하 고 1.1.5에 설명 된 조건 하에서 성장의 8 일 후 두 장미 잎을 생성.</li>
		<li>토양에 유전자 변형 식물을 전송 및 1.1.6 및 1.1.7에 표시 된 대로 그들을 육성.</li>
		<li>독립적인 T1 라인에서 T2 씨앗을 수집 합니다. MS hygromycin 접시에 씨앗을 뿌리 다, DR5 GFP 삽입 (민감한 식물에 저항 하는 식물의 비율이 될 것 이다 대략 3:1)의 복사본 하나를 운반 하는 식물을 선택 하 고 토양에 그들을 전송.</li>
		<li>1.1.6에 1.1.7 같이 t 2 식물을 육성.</li>
		<li>T2 식물에서 T3 씨앗을 수집 합니다. MS hygromycin 접시에 씨앗을 뿌리 다, homozygous 유전자 변형 식물 (모두 한 줄에서 식물의 전시 hygromycin 저항)을 선택 하 고 토양에 그들을 전송.</li>
		<li>1.1.8에 표시 된 대로 homozygous T3 식물의 꽃 봉 오리를 표시 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP 신호 관측
	<ol>
		<li>6% 글리세롤 솔루션을 생성 하기 위해 초순의 47 mL와 글리세롤의 3 mL를 혼합.</li>
		<li>양면 접착 테이프의 조각 유리 현미경 슬라이드를 부착 하 고는 silique 1.3.1에 표시 된 대로 수정.</li>
		<li>주사기 바늘으로는 pseudoseptum의 양쪽에 carpels를 분할 하 고 1.3.2에 표시 된 대로 stereoscope 아래 슬라이드에 두 개의 해 부 carpels를 연결 합니다.</li>
		<li>유리 슬라이드에 6% 글리세롤의 30 µ L를 분배 고 해 부 carpels에서 ovules의 모든 솔루션 뾰족한 핀셋을 사용 하 여 합니다. 부드럽게 슬라이드에는 coverslip을 놓습니다.</li>
		<li>씨 외 투 및 각 난에 endosperm GFP 신호 태아에서의 관찰을 방지할 수 있습니다,으로 난에서 태아를 추출 합니다. 신속 하 고 부드럽게 슬라이드를 누릅니다 (더 성숙한는 난은, 슬라이드에 더 적은 힘을 적용 한다)는 난에서 태아를 돌출 시킬.</li>
		<li>GFP 형광 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여에 대 한 슬라이드를 검사 합니다. 낮은-전력 분야 (10 배)에서 격리 된 배아를 찾을 그들의 위치를 기록 그리고 DR5 GFP 식 배아에 488을 여기 광원을 설정 하 여 관찰 하 고 전력 분야 (100 X 기름 침수 렌즈) 변경 GFP 신호 검출에 대 한 nm.</li>
		<li>추가 분석을 위해 적당 한 T3 라인 선택 배아에 GFP 식 감지.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 특성화의 난 클리어런스 및 마커 단백질 관찰을 통해 배아 치명적인 돌연변이에 배아 패턴 형성: 예를 들어 Naa10
<ol>
	<li>Naa10 돌연변이 식물에 모방 하는 태아
	<ol>
		<li>1.1.1-1.1.7에 표시 된 대로 식물 재료를 준비 합니다.</li>
		<li>Naa10식별+ / − 식물 유전자 특정 뇌관5, 다음 표를 사용 하 여 PCR에 의해 naa10의 꽃 봉 오리+ / − 1.1.8에 표시 된 대로 식물.</li>
		<li>난 정리 및 naa10의 현미경 검사 수행+ / − 배아 1.2와 1.3에 표시 된 대로.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naa10 배아를 사용 하 여 마커 단백질 분석
	<ol>
		<li>2.1-2.2에 명시 된 절차를 사용 하 여 적합 한 DR5-GFP 유전자 변형 라인을 얻을.</li>
		<li>구나10 homozygous DR5-GFP 유전자 변형 라인 크로스+ − naa10를 공장+ / − 식물 homozygous GFP 형광 마커 (유전자 특정 PCR에 의해 식별 된) F2 세대에서 naa10특성을+ −5 GFP 신호 homozygous DR5 GFP 라인을 사용 하 여 현미경으로 관찰 하 고.</li>
		<li>Naa10의 꽃 봉 오리를 표시+ / − DR5-GFP 2.1.7에서 homozygous 식물.</li>
		<li>DR5-GFP 2.2에서 homozygous naa10 배아에서 GFP 신호에 대 한 검색.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li><li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+flowering+plants:+setting+up+the+basic+body+pattern.">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li><li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model.">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li><li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+plant:+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis.">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li><li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+monopteros+gene+in+organising+the+basal+body+region+of+the+Arabidopsis+embryo.">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis.">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation.">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li><li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li><li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8.">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li><li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein.">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

난 클리어런스는 세포 분열을 감지 하 고 애기;에서 embryogenesis 동안 형태를 평가 하는 유용한 방법 이 기술을 사용 하 여, 배아 DIC 현미경5,12에서 직접 관찰할 수 있습니다. 난 정리를 위한 중요 한 단계는 단계 1.3.4. 1.3.4 단계에서 난 허가에 필요한 시간은 변수입니다. 2/4-셀 단계에서 배아 Hoyer의 솔루션에서 2 시간 후 그들은 불명료 한 후 12 h 보이...

Embryogenesis 높은 공장 개발에서 초기 이벤트입니다. 세포 분열 및 엄격한 유전자 제어1,2차별화 통해 zygote에서 성숙한 배아 형태. 애기 배아는 embryogenesis 동안 세포 분열의 순서 예상된 패턴3,4를 따르기 때문에 morphogenesis의 제어를 공부 하는 유용한 모델입니다. 그러나, 여러 셀에 하나를 포함 하는 애기 배아 관찰 하 고 분석에 너무 작습니다. 또한, 특정 유전자의 돌연변이 배아 치 사 율5, embryogenesis에서 그 유전자의 중요 한 역할을 나타내는 발생할 수 있습니다. 배아-치명적인 돌연변이에 패턴 형성의 특성 필수 유전자 배아 개발을 규제 하는 의하여 분자 메커니즘을 이해 하기 위한 기초를 제공 한다.
자세한 방법은 직접 현미경 관찰에 의해 모델 공장 애기 배아 패턴 형성 특성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. 방법은 난 클리어런스를 배아의 현미경 관찰에 의해 다음을 포함 한다. 배아-치명적인 돌연변이의 특성 또한 설명 되어 있습니다.
다른 발달 단계에서 배아의 형태 Hoyer의 솔루션6,7지운 ovules를 사용 하 여 현미경으로 직접 확인할 수 있습니다. 이러한 ovules 전시 높은 굴절률; 따라서, 메서드를 비운이 난 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경으로 관찰 한다 견본을 위해 특히 유리 하다.
또한, embryogenesis 동안 특정 셀 또는 셀 제한 된 수에 표현 되는 유전자 배아에서 세포를 식별 하기 위해 마커로 사용할 수 있습니다. 따라서, embryogenesis 동안 셀 id 사양 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 GFP 태그 마커 단백질의 식이 모니터링 하 여 주석 첨부 될 수 있습니다. 반대로, 그것이 embryogenesis 중 한 알 수 없는 기능 유전자-GFP 융해의 식 패턴을 관찰 배아 패턴화와 그 유전자의 표현 사이의 링크를 제공를 애기에 embryogenesis에 필요한 새로운 유전자의 식별을 용이 하 게 됩니다.
여기 설명 하는 방법을 사용할 수 있습니다 또한 배아 치명적인 돌연변이의 표현 형을 특성화 하 고 세포 수준에서 embryogenesis에 영향을 받는 유전자의 영향을 확인 하. 또한, 함께 비교 마커 유전자의 표현 패턴의 야생 형 및 돌연변이 식물 사이 embryogenesis 동안, 방법은 분자 메커니즘 및 신호 경로 embryogenesis8,9에 참여에 대 한 단서를 얻을 수 있습니다. 실제로, 메서드 naa10 식물에 적용 된 그리고 그것은 돌연변이에 hypophysis의 비정상적인 부문 변화 embryogenesis5동안 auxin 배포에 의해 발생할 수 있습니다 발견 했다.

<table><tbody><tr><td>Chloral Hydrate</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Medium</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>camera: AxioCam 506 color</td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>filters: BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>camera: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>nutrient-rich soil</td><td>KLASMANN, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-mL tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sodium hypochlorite solution</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>sucrose</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>glycerol</td><td></td><td></td><td>Domestic analytical reagent</td></tr><tr><td>culture dish</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>glass slide</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>syringe needle</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>fine-tipped tweezers</td><td></td><td></td><td>Domestic supplies</td></tr><tr><td>super clean bench</td><td></td><td></td><td>Domestic equipment</td></tr></tbody></table>

a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis

그들의 개발의 높은 예측 가능한 특성을 감안할 때, 애기 배아 사용 되었습니다 모델로 morphogenesis 식물에서의 연구에 대 한. 그러나, 초기 단계 공장 배아 작은 그리고 그들을 관찰 하 고 분석 어렵게 만드는 몇 가지 셀을 포함. 메서드는 특성화 모델 유기 체 애기를 사용 하 여 현미경으로 식물 배아에서 패턴 형성에 대 한 여기 설명 되어 있습니다. Hoyer의 솔루션을 사용 하 여 신선한 ovules의 정리, 다음에 휴대폰 번호와 배아의 형태 관찰 될 수 있었다, 그리고 그들의 발달 단계는 기름 침수 렌즈 X 100을 사용 하 여 미분 간섭 명암 현미경에 의해 결정 될 수 있었다. 또한, 특정 마커 단백질 녹색 형광 단백질 (GFP)와 태그의 표현 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 셀 id 사양 배아 패턴화 하는 동안 주석을 모니터링 했다. 따라서, 세포 및 분자 수준에서 야생-타입 식물 배아에서 패턴 형성을 관찰 하 고 야생-타입 식물 및 배아 치명적인 돌연변이 배아에서 패턴 형성을 비교 하 여 모방 하는 태아에서에서 특정 유전자의 역할을 특성화 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 따라서 메서드는 애기에 embryogenesis 특성을 사용할 수 있습니다.

이 문서에서 설명 하는 방법은 embryogenesis 직접 현미경으로 관찰 하 고, 특정 마커, embryogenesis 동안 셀 id 사양 주석을 추가 하 고 embryogenesis 동안 특정 유전자의 역할의 특성을 사용할 수 있습니다.
배아 (성숙한 스틱 산책 단계로 길쭉한 접합 자 단계)에서 야생-타입 애기 에 패턴의 분석에서 대표적인 결과 <strong class="xfig"...

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A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

11.0K 조회수.  Capital Normal University. 이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

연구

발생학

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

생물학

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant productivity and survival. As such, understanding the mechanisms by which stomata develop and pattern has tremendous agronomic value. This paper describes two phenotypic methods using Arabidopsis cotyledons that can be used to characterize the genes controlling stomatal development and patterning. Presented first are procedures for analyzing the stomatal phenotypes using toluidine blue O-stained cotyledons. This method is fast and reliable and does not require the use of epidermal peels, which are widely used for phenotypic analyses but require specialized training. Due to the presence of multiple cysteine residues, the identification and generation of bioactive EPF peptides that have a role in stomatal development have been challenging. Thus, presented second is a procedure used to identify stomatal ligands and monitor their biological activity by bioassays. The main advantage of this method is that it produces reproducible data relatively easily while reducing the amount of peptide solution and the time required to characterize the role of the peptides in controlling stomatal patterning and development. Overall, these well-designed protocols enhance the efficiency of studying the potential stomatal regulators, including cysteine-rich secretory peptides, which require highly complex structures for their activity.

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

This paper describes two phenotyping methods without the use of epidermal peels to characterize the genes controlling stomatal development. The first method demonstrates how to analyze a stomatal phenotype using a toluidine blue O-stained plant epidermis. The second method describes how to identify stomatal ligands and monitor their biological activities.

표피 표현형 점수를 통한 기공 발달에 관여하는 유전자 식별

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

요약

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모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜

애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법

표피 표현형 점수를 통한 기공 발달에 관여하는 유전자 식별