이 프로토콜은 연구원이 유방 상피 세포의 다른 하위 집합에서 인간 적인 유방암 발달을 다시 상백하기 위하여 마우스 모형의 새로운 모형을 생성하는 것을 도울 것입니다. 이 기술은 연구원이 광범위한 마우스 사육을 위한 필요 없이 세포 모형 특정 방식으로 발달 단계 조직에 있는 유방암 마우스 모형을 생성할 수 있게 합니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플로크스 마우스를 생성, 유지 관리 및 마취합니다.
수술이 수행될 영역과 는 별개의 영역으로 마우스를 가져오십시오. 발가락 핀치를 수행 하 여 마취를 확인 한 후, 수술 절차에 대 한 준비를 킬로그램 당 5 밀리 그램의 복용량에서 실체로 멜록시캄을 주입. 제모 크림 몇 방울을 적용하여 젖꼭지 수술 부위를 노출하십시오.
부드러운 종이 타월을 사용하여 과도한 크림과 느슨한 머리카락을 제거하십시오. 면도는 젖꼭지의 손상을 피하기 위해 권장되지 않습니다. 먼저 70 %의 알코올다음으로 요오도프로 수술 부위를 소독하고 스크럽 요도의 최종 적용으로 끝납니다.
거즈 스폰지 또는 면에 기울어진 어플리케이터를 사용하여 작업 영역의 중심에서 주변으로 원을 그리며 이 작업을 수행하십시오. 주기를 3~4회 반복합니다. 외과 적 수술 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다.
두 네 번째 잉게인 유방 땀샘 사이의 약 1 센티미터길이로 피부에 절개 부위를 만듭니다. 유방 덕트 트리를 시각적으로 정수리 복막에서 피부 플랩을 조심스럽게 분리합니다. 조심스럽게 마이크로 절제 가위를 사용하여 근처의 피부를 절단하지 않고 외부 젖꼭지를 제거하기 위해 워치 메이커의 집게로 젖꼭지를 잡아.
33 게이지 금속 허브 바늘이 부착된 25 마이크로리터 해밀턴 주사기에 크레아데노바이러스 주입 혼합물의 약 3~5마이크로리터를 적재한다. 혼합물에 포함된 청색 염료에 기초하여 주사기내의 주사 혼합물의 부피를 추정한다. 미세한 곡선 트위저로 피부 플랩의 가장자리를 부드럽게 잡고 유방 덕트 트리에 푸른 염료의 확산을 모니터링하면서 Cre-adenovirus 주입 혼합물을 젖꼭지에 천천히 주입합니다.
덕트 루멘의 손상을 피하기 위해 가능한 한 느리게 주입 속도를 유지합니다. 성공적인 내트라덕트 주입은 스트로마 구획으로 누출되지 않고 전체 덕트 트리 전체에 퍼지는 주입 된 유체에 의해 표시됩니다. 주입된 액체의 누출을 피하기 위해 젖꼭지에서 바늘을 부드럽게 철회합니다.
매명선의 탈면 또는 주입된 젖꼭지의 주변 부위를 검사합니다. 여기에 표시된 바와 같이 근처 스트로마로 확산염료는 성공적인 내막 주사보다는 유방 지방 패드 주사를 나타냅니다. 상처 클립으로 피부의 수술 상처를 닫습니다.
마취에서 마우스를 제거하고 복구를 위해 깨끗한 케이지 내부의 가열 패드에 놓습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 유방 종양의 발달을 모니터링한다. 자궁 내 주사를 성공적으로 수행 할 수있는 가장 젊은 여성 마우스는 약 3 주에 그입니다.
대부분의 유방 종양 유도 실험에 대 한 비록, 젊은 성인 여성 마우스 사용 됩니다. 주사 혼합물의 더 큰 부피를 가진 내트라덕트 주사는 폐포 세포를 표적으로 하기 위하여 초기에서 중간 임신 도중 여성 마우스에서 수행될 수 있다. 유방 종양 유도를 위한 상이한 유방 상피 세포 하위 집단을 표적으로 하기 위하여, 다른 유방 상피 세포 subset 특정 프로모터의 통제 하에 Cre-adenoviruses는 주입을 위해 이용되었다.
예를 들어 케라틴 8 프로모터의 제어하에 Cre-adenovirus는 발광 유방 상피 세포를 표적으로 하는 데 사용되었다. 케라틴 5 프로모터의 통제 하에 있는 Cre-adenovirus는 기저 유방 상피 세포의 유전 표시로 이끌어 내는 기저 혈통을 표적으로 했습니다. ROSA26-YFP 리포터를 가진 여성 P53 floxed homozygous 마우스의 경우, 케라틴 8 Cre-adenovirus의 내막 주사는 주사 후 몇 달 후에 유방 종양의 발달로 이끌어 냈습니다.
조건부 R26-Y 기자의 포함으로 인해 종양 상피 세포는 전형적으로 YFP에 의해 표시되었으며 유동 세포측정에 의해 검출될 수 있었다. 세포는 추가 분석을 위해 YFP 양성 세포의 유량 분류에 의해 농축될 수 있다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 작은 주사 볼륨을 사용하고 천천히 주입하고 바늘을 천천히 철회하는 것입니다.
이 절차에 따라, 하나는 주입 된 동맥의 세포 질 또는 공동 면역 형광 염색에 의해 사전 악성 및 암 단계에 표적 YFP 양성 유방 상피 세포의 진행을 모니터링 할 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 유방암의 기원의 세포를 공부하는 방법, 다른 자가 발생에 어떻게 반응하는지 그리고 암세포에 어떻게 진행되는지 연구하는 길을 열어줄 것입니다. 아데노바이러스와 주사바늘 은 모두 잠재적으로 위험합니다.
따라서, 하나는 항상 장갑을 착용하고 내회 주사를 수행 할 때 안전 바늘과 주사기를 사용해야합니다.
