이 두개 내 주사 프로토콜은 정확한 주사, 일상적인 모니터링 및 정확한 종양 볼륨 측정을 허용하여 뇌 전이 메커니즘의 보다 효과적인 연구를 할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 간두개 종양 성장의 연쇄 모니터링을 허용한다는 것입니다. 절차를 보여주는 조나단 스페하르, 크기 모어 실험실에서 대학원 연구 동료, 안나 Bratasz, 오하이오 주립 대학 작은 동물 이미징 공유 자원에서 이미징 연구 과학자.
절차를 시작하기 전에 드릴의 스테이지 잠금을 비틀어 드릴 비트 어댑터를 만들고 1밀리미터 드릴 비트를 드릴에 삽입하고 비트 잠금을 수동으로 조여 드릴을 잠급합니다. 드릴을 스테레오테프레임에 부착하고 디지털 인젝터 전달 속도를 분당 0.4 마이크로리터로 설정하고 두 개의 마이크로리터를 목표로 합니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후 마취 된 마우스를 프레임에 놓고 면 팁 어플리케이터의 무딘 끝을 사용하여 입 바의 쓰루에 치아를 배치하십시오.
왼쪽 이어 막대를 왼쪽 귀의 내측 캔투스에 대고 두개골을 안정시키고 스테레오전술 프레임의 나사를 사용하여 두개골을 제자리에 고정시하십시오. 그런 다음 같은 방식으로 오른쪽 귀 막대와 두개골의 다른 쪽을 확보합니다. 칼변변경 창을 만들기 위해, 세 가지 순차적 교대 베타딘 용액과 70 %에탄올 스크럽으로 두피를 청소하고 처진 봉합선 다음 두개골의 중앙 중앙 측면을 따라 피부를 통해 3 mm 절개를 만들기 위해 멸균 메스를 사용합니다.
멸균 드릴 비트를 bregma에 수직으로 식별하고 방향을 지정하여 디지털 vernier 스케일을 0으로 재설정하고 드릴 비트를 2밀리미터 측면으로 시상 봉합사및 1밀리미터 앞쪽으로 관상 봉합사에 이동시확인합니다. 드릴에서 피부를 멀리 이동하고 최고 속도를 사용하여 랜드 마크에주의를 기울이고, 조심스럽게 구멍을 드릴, 약 0.5 밀리미터 깊이, calvaria를 통해, 필요에 따라 멸균 식염수의 방울로 드릴 사이트를 냉각. calvarial 창이 만들어지면 드릴을 조심스럽게 들어 올리고 스테레오전술 프레임에서 드릴을 제거합니다.
암세포 주입의 경우, 자동 인젝터 유닛을 스테레오전술 장치에 부착하고 DPBS에서 철저하게 재장매된 세포의 6~8마이크로리터를 멸균 해밀턴 주사기로 적재한다. 주사기를 인젝터에 적재하고 소량의 용액을 일회용 멸균 드레이프에 분배하여 주사를 위한 바늘을 프라이밍합니다. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 주사기를 70% 에탄올로 닦고 바늘 끝을 칼변변 창 중앙에 맞추어 노출된 뇌에 거의 닿을 때까지 정렬합니다.
디지털 버니어 스케일을 0으로 재설정하고 바늘을 뇌에 3밀리미터 깊이로 천천히 삽입합니다. 주입 부위에 세포 전달을 시작하기 위해 인젝터 화면에서 실행을 선택하기 전에 적어도 60 초 동안 뇌에 바늘을 둡니다. 모든 세포가 전달되었을 때, 바늘이 적어도 3 분 동안 뇌에서 휴식을 취하여 뇌 의 parenchyma가 분당 0.75 밀리미터의 속도로 뇌에서 바늘을 철회하기 전에 주사에 적응할 수 있도록 하십시오.
종양 부담의 자기 공명 화상 진찰을 위해, 적당한 실험 시점에서 화상 진찰의 앞에 100 분, 표준 관면 주입에 의해 마우스에 체중 가돌리늄 기지를 둔 조영제의 20 그램 당 100 마이크로 리터를 관리합니다. 마우스 를 주입 후 마취시키고 마취 된 마우스를 가열 된 홀더에 놓습니다. 홀더를 마우스 뇌 표면 코일을 장착한 9.4 T 자석에 넣고 국소화 이미지를 얻습니다.
그런 다음 T2 가중 희귀 시퀀스를 사용하여 마우스 뇌를 이미지하고 가돌리늄 기반 의 대비 T1 가중 희귀 시퀀스를 게시합니다. 총 종양 부피를 측정하기 위해 ImageJ에 대한 관심있는 MRI 데이터 파일을 열고 무료 손 선택 도구를 사용하여 종양 주위에 윤곽을 그립니다. 그런 다음 분석 탭을 열고 측정값을 선택하여 선택한 영역의 영역을 가져옵니다.
특정 시점에서 개별 마우스에 대한 슬라이스를 포함하는 모든 종양이 평가되면 값을 적절한 데이터 분석 프로그램으로 내보냅니다. 여기서, 7일째및 10일째에 단일 마우스에 대한 종양 부피 정량화의 대표적인 개요를 관찰할 수 있다. 스캔 당 30 슬라이스의 평가는 이 분석을 위해, 7 일째 에 주사 후, 5 개의 조각은 종양 부담을 나타냈다는 것을 밝혔습니다.
10일째되는 동안, 9개의 슬라이스는 종양 부담을 나타냈다. 각 이미지의 종양 영역은 그 때 입증된 대로 측정되었고, 시간이 지남에 따라 종양 부피의 변화를 추적할 수 있게 되었다. 각 세포주 및 각 받는 사람 마우스 모델은 고유하므로 이미징 정확도를 보장하기 위해 주입된 셀 수와 MRI 일정의 최적화가 필요합니다.
이 절차에 따라, 뇌는 근본적으로 모든 다운 스트림 분석에 대 한 수확 될 수 있습니다., 단일 세포 격리 또는 조직 병리학 분석을 포함 하 여.
