Name: sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification
Uploaded: 2017-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
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저자는이 프로젝트에 대한 기술적 전문성과 지원으로 Pam Ovwigho, Tenette Jones 및 NIEHS의 Natasha Clayton을 인정하고자합니다.

이 연구를위한 모든 동물의 사용과 절차는 NIEHS 실험 동물 보살핌 및 사용위원회와 협회의 평가 및 인정 협회에서 실험 동물 관리 인증 시설. 1. 유방 전체 마운트 준비 2 , 3 , 6 , 7 <ol><li> 참조 3에 설명 된대로 임신하지 않은 CD - 1 암컷 마우스의 한쪽에서 사타구니의 유선을 제거하고 정전기가있는 슬라이드에 올려 놓습니다. </li><li> 글 랜드를 붙지 않는 종이 또는 필름으로 덮고 다른 슬라이드를 맨 위에 놓습니다. 글 랜드가 슬라이드에 고정되어 고정되도록 글 랜드를 평평하게 펼치기 위해 슬라이드에 압력 ( 예 : 물 무게)을가하십시오. </li><li> 슬라이드를 고정액 ( 예 : 100 % 에탄올, 클로로포름, 빙초산 6 : 3 : 1 비율)에 담근다.실온에서 하룻밤. </li><li> 정착액에서 땀샘을 제거하고 에탄올에서 15-30 분 동안 씻으십시오. 30 분 세척 후에 에탄올 1/3을 붓고 물을 가하여 서서히 물로 변합니다. 매번 약 5 분 동안 씻으십시오. 그리고 물을 3 번 더 가하여 반복하십시오. </li><li> 12-24 시간 동안 얼룩 ( 예 : 카민 연금 용액). 참고 : 두꺼운 조직은 더 긴 염색 시간을 필요로합니다. 자세한 염색 방법은 참고 문헌 3 을 참조하십시오. </li><li> 할당 된 시간 후에 얼룩을 털어 내고 슬라이드를 30 초 동안 물에 헹구십시오. 95 % 에탄올에서 15 분 씻고 20 분 동안 100 % 에탄올에서 최종 씻음을 수행하여 15 분 동안 70 % 에탄올에서 슬라이드를 세척하여 조직을 탈수. </li><li> 조직을 두껍게하면 최소 24 시간 이상 자일 렌에 넣고 조직에서 지방을 제거하여 불투명 한 부분이나 흰색 부분을 제거합니다. </li><li> 자일 렌에서 티슈를 제거하고 신속하게 m조직 탈수증을 피하기 위해 슬라이드에 매체를 ounting; 상단에 coverslip을 놓으십시오. 적어도 48 시간 동안 슬라이드를 건조시킵니다. </li><li> 2 에서 설명한대로 전체 장착 된 조직을 비정상 상태로 평가하십시오. 참고 : 병변이 전체 마운트에서 감지되고 신원 확인을 위해 절편이 필요한 경우 다음 단계를 따라야합니다. </li></ol> 2. 유리 슬라이드에서 유방 전체 마운트 제거 <ol><li> 유성 전체 마운트 슬라이드를 자일 렌으로 가득 찬 유리 얼룩 항아리에 담그고 coverslip 및 장착 매체를 제거하십시오. 참고 : 과도한 장착 솔루션으로 두꺼운 조직과 슬라이드는 커버 슬립 제거에 추가 시간이 필요할 수 있습니다. </li><li> 초기 밤새 담가 준 다음, 슬라이드를 신선한 크실렌에 넣고 6 시간 동안 담그십시오. 신선한 크실렌에 마지막으로 한 번 담근다. 참고 : 커버 슬립은 마지막 담금 후 슬라이드에서 쉽게 떨어집니다. </li><li> ag손을 사랑, 슬라이드를 잡고 조심스럽게 한 조각에 제거되도록 포셉 한 쌍의 coverslip을 제거하십시오. 참고 : coverslip 여전히 유리 슬라이드에 첨부 된 경우, 약간의 노력으로 제거 할 수있을 때까지 몸을 담그기를 계속하십시오. </li><li> coverslip가 제거되면, 자일 렌을 포함 유리 페트리 접시에 수직으로 슬라이드를 잡고 신중하게 날카로운, 일회용 면도날을 가지고 슬라이드 아래로 단일 운동에 블레이드를 슬라이드. </li><li> 일단 조직이 제거되면, 유분 패드를 크실렌이 채워진 유리 페트리 접시에 신속히 잠기 게하여 조직이 공기 건조하지 않도록하십시오. 참고 :이 단계에주의하십시오. 전체 마운트는 얇고 (≤ 1 mm) 크실렌 가공으로 인해 깨지기 쉽습니다. 모든 인상이나 눈물이 조직의 형태를 변화시키고 나중의 평가를 복잡하게 만들 수 있습니다. </li></ol> 3. 조직 처리 <ol><li> 일단 조직이 페트리 접시에 있으면 신중하게 그것을 전송표지 된 조직 학 카세트에. 뭉툭한 코 모양의 톱니 모양의 집게로 지방 패드의 가장자리를 잡고 조직 손상을 최소화하십시오. <ol><li> 면도칼을 사용하여 더 큰 조직 (특히 쥐의 경우)을 반으로 잘라내어 조직 크기를 수용 할 수있는 두 개의 별개의 분류 된 카세트에 두십시오. 조직을 오른쪽면을 위로 향하게합니다 (참조로 림프절을 사용하십시오). 림프절이없는 조직을 카세트로 옮길 때 똑바로 세우십시오. </li></ol></li><li> 카세인을 키 실렌 용기에 넣고 최대 2 시간 동안 티슈 프로세서에 넣습니다. 참고 : 샘플을 카세트에 넣은 당일에 샘플을 처리하는 것이 좋습니다. 크실렌에 장시간 담그는 것은 테스트되지 않았습니다. </li><li> 최대 수의 카세트를 손으로 티슈 프로세서에 넣으십시오. </li><li> 시작하기 전에이 프로세스에 사용될 모든 시약을 프로세서의 시약 목록에 프로그래밍하십시오. 이동을 자동화하려면한 스테이션에서 다른 스테이션으로 이동하려면 메뉴 옵션을 사용하여 새 프로그램을 작성하십시오. 모든 단계가 완료되면 &#39;확인&#39;을 선택하여 계속 진행하십시오. 참고 : 프로세서는 시작하기 전에 모든 스테이션 세부 정보를 검토 할 수 있습니다. <ol><li> 37 ℃에서 30 분 동안 크실렌에 카세트를 담그도록 프로세서를 자동화 한 다음 동일한 조건에서 새 크실렌에 두 번째 담그십시오. 프로세서를 자동화하여 자일 렌 용액에서 카세트를 제거하고 조직을 60 ° C에서 30 분 동안 1 : 1 크실렌 : 용융 파라핀 혼합물이 들어있는 다음 스테이션으로 옮깁니다. 참고 : 프로세서는 용융 된 파라핀이 들어있는 새 챔버에 카세트를 1 시간 동안 옮깁니다. 1 시간 후 시료는 새로운 용융 파라핀의 새로운 챔버로 자동 이송되어 2 시간 더 처리됩니다. 두 단계 모두 60 ° C에서 수행됩니다. </li><li> 프로세서는 용융 된 파라를 포함하는 스테이션으로 카세트를 이송합니다1 시간 동안 ffin. 그런 다음 샘플을 자동으로 새로운 용융 파라핀 최종 스테이션으로 옮기고 추가 2 시간 동안 가공합니다. 두 단계 모두 60 ° C에서 수행됩니다. </li></ol></li></ol> 4. 가공 유방 조직 삽입 <ol><li> 몰드에 조직을 삽입 할 준비가 될 때까지 삽입 스테이션의 58 ° C 파라핀 고정 탱크에 카세트를 놓습니다. </li><li> 카세트 커버를 제거하여 조직의 최적 금형 크기를 결정하십시오. 곰팡이가 조직을 수용하기에 충분히 큰 지 확인하고 조직이없는 경계선 주위에 파라핀이없는 충분한 공간을 남겨 둡니다. </li><li> 용융 된 파라핀 3 ~ 4mm를 금형에 넣고 유리 슬라이드의 하단과 카세트의 바닥에 인접한 유성체 전체 표면을 금형에서 위로 향하게합니다. </li><li> 금형을 냉각 판에 옮기고 필요에 따라 금형과 평행이되도록 조직을 신속하게 조정하십시오. b오트밀. 참고 : 파라핀이 경화되면 조직이 제자리에 고정됩니다. </li><li> 따뜻한 포셉을 사용하여 카세트의 아래쪽 절반을 금형 위에 놓습니다. 포셉을 사용하여 단단히 누르십시오. </li><li> 연속 카세트 전체를 덮기 위해 추가로 용융 파라핀을 몰드에 추가하십시오. 몰드를 따뜻한 판에서 차가운 판으로 이동시켜 블록의 경화를 완료하십시오. </li><li> 파라핀이 완전히 응고되어 균열이나 공기 방울이 생기지 않는 경우 금형에서 블록을 제거합니다. 참고 : 파라핀 묻힌 조직을 준비가 될 때까지 실내 온도에 보관하십시오. </li></ol> 5. Microtome에 파라핀 묻힌 유방 조직 단면도 <ol><li> sectioning하기 전에 -20 ° C에서 1 시간 파라핀 블록을 품어. 참고 : 원래 덮개가 달린 전체 장착 티슈에서 블록에 잔여 장착 매체가 있습니다. 블록을 차게하면 블록 세분화 및 리핑이 향상됩니다. </li><li> 마이크 준비하기신선한 증류수가 들어있는 수조를 켜고 42-45 ° C로 온도를 조절하여 로토메를 얻는다. 신선하고 얇은 날을 마이크로톰 위에 놓고 4 μm로 설정하십시오. 참고 : 조직에 잔여 장착 매체가 있기 때문에 단면 품질이 4 μm보다 두꺼운 부분은 줄어 듭니다. </li><li> 왁스가 블레이드를 마주하고 수직면과 정렬되도록 블록을 마이크로톰에 삽입하십시오. 그런 다음 차가운 물에 거즈 패드 부분을 적신 다음 몇 분 동안 블록 위에 놓습니다. </li><li> 거친 고급 휠과 함께 시계 방향으로 커다란 바퀴를 돌리면서 블록의 전체면이나 대표 부분을 얻을 때까지 블록을 분할하십시오. 참고 : 조직은 전체 장착 과정에서 크실렌 제거 때문에 얇습니다. 블록을 블레이드와 올바르게 정렬하여 대표 섹션을 얻는 데 필요한 절단 수를 최소화합니다. </li><li> 리본을 선택하십시오.섹션을 손으로 조심스럽게 뜨고 (45 ° C) 따뜻한 물통 (사전 준비)에 리본을 조심스럽게 올려 놓고 조직 주름이 흩어 지도록 조심스럽게 섹션을 깨끗한 유리 슬라이드 위에 띄웁니다. </li><li> 과도한 물을 제거하기 위해 슬라이드를 건조 랙에 똑바로 세웁니다. 37 ° C에서 약간 열린 슬라이드 상자에 슬라이드를 품어주십시오. </li></ol> 6. 단면 유방 조직의 자동 및 수동 H &amp; E 염색 <ol><li> 얼룩이지기 전에 슬라이드는 실온에서 보관됩니다. </li><li> 자동 염색의 경우 기본 메뉴의 얼룩 옵션에서 H &amp; E를 선택하십시오. 탈 파라핀 화, 염색 및 탈수는 모두 자동화 된 염색기에서 완료됩니다. 장착 매체와 coverslip을 사용하여 섹션을 마운트하십시오. </li><li> 수동으로 슬라이드를 염색 경우, 5 분 동안 자일 렌에 슬라이드를 immersing하여 섹션을 deparaffinize. 신선한 크실렌으로 옮기고 5 분 동안 반복하십시오. </li><li> thers immersing하여 슬라이드 rehydrateem 100 % 에탄올에서 2 분씩 3 분간 처리 한 후 95 % 에탄올에서 2 회 반복하고 5 분마다 1X 세척 완충액에서 2 회 세척한다. </li><li> 슬라이드를 증류수로 헹구십시오. </li><li> 1-2 분 동안 hematoxylin에 슬라이드를 추가합니다. 슬라이드를 꺼내 5 분 동안 흐르는 수돗물로 헹굽니다. 참고 : 사용 전 헤 마톡 실린을 걸러냅니다. </li><li> 슬라이드를 1 % 빙초산에 넣고 30 초간 분화를 촉진시킨 다음 1 분 동안 수돗물로 헹구십시오. </li><li> 30 분 ~ 1 분 동안 1X PBS에 슬라이드를 추가하여 조직 절편을 파란색으로 한 다음 수돗물로 5 분간 헹구고 15 ~ 20 초 동안 95 % 알코올로 헹군다. </li><li> 30 초에서 1 분간 에오신 용액으로 대조 염색하십시오. 다음에, 신선한 95 % 에탄올에서 두 번 탈수 해 100 % 에탄올에서 2 번 반복합니다. 각 세척을 5 분 동안 수행하십시오. </li><li> xylene에있는 슬라이드를 각각 5 분 동안 두 번 변경하십시오. </li><li> Coverslip장착 매체와 조직 섹션과 상온에서 하룻밤 건조 플랫. </li></ol>

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저자는이 기사의 연구, 저자 및 / 또는 출판과 관련하여 선언 할 수있는 이해 관계가 없습니다.

유선의 전체 마운트는 내분비 교란 물질을 포함한 화학 물질에 노출 된 후에도 발생할 수있는 정상적인 유방 발달 및 형태 학적 변화를 설명하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 동일한 동물의 전체 산과 H &amp; E 섹션을 함께 평가하면 조기 변경에 대한 정확한 시각적 스냅 샷을 제공 할 수 있으며, 이는 더 병이있는 상태로 진행될 수 있습니다. 이 유용한 정보를 얻을 ?...

mammary whole mountis는 정상적이고 화학적으로 유도 된 비정상적인 발달을 이해하기 위해 많은 쥐와 마우스 연구에서 구현 된 유용하고 저렴한 방법입니다. 일반적으로 설치류 개발 단계 ( 예 : 사춘기, 사춘기, 중기 - 후기 및 출생기)에 여러 단계로 수집 된 유선은 우상, 내분비 및자가 분비 인자에 의해 영향을받는 조직 및 세포 구조의 형태 학적 변화를 보여줍니다 1 . 노화 된 쥐에서, 선의 상피 및 간질 부분이 점차적으로 밀도가 높아져서 전체적인 형태로 형태 학적 매개 변수를 측정하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 미시적 수준의 변화를 확인하기 위해 조직 학적 평가를 위해 림프를 수집하는 것이 일반적입니다. 두 공정 모두 화학적 노출 ( 즉, 환경 적 또는 약학 적)과 관련된 연구 또는 유전 적 변화에 따른 형태 학적 변화를 조사하는 데 특히 유용합니다ations. 위험 평가에서 유선을 사용하기위한 기술과 기능은 계속 진화하고 있습니다. 전체 장착 준비가 일상적이고 표준화되어있는 반면, 절편 수정은 2 , 3 단계로 이어 집니다. 일부 실험실은 아직 피부 사를 통해 크로스 컷 섹션을 사용하는 동안 다양한 배경 (즉, 학계, 정부 및 업계)에서 많은 연구 그룹은, 바람직한 방법으로 유방 조직의 종 방향 / 코로나 섹션을 채택했다. 후자의 방법은 관심있는 조직 (유선 상피 2 )보다는 표피 (피부)를 과도하게 표현합니다. 코로나 또는 종단면 인해 증가 된 표면적 및 본 구조물의 개수 이상 병변의 검출을 향상 크게 정상 조직 5 특징과 더 유용하다. 전반적으로 이것은 전체 mo를 만듭니다.유선의 비교 조직 병리학 적 평가를위한 적절한 방법 1 , 2 . 사타구니 동맥 번째 마우스 또는 래트, 검색하고, 4 번째 및 5의 보존을 사용하는 것은 매우 전체 비교 추천 여부 반대측 H &amp; E 부분에 장착. H &amp; E 섹션과 전체 마운트는 환경 노출로 인한 세포 및 형태 학적 변화에 대한 정확한 설명을 제공합니다. 이는 모델이 종양 형성에 대한 감수성이 낮거나 종양이 현저하게 보이지 않는 특정 설치류 계통에서 특히 그러하다. 경우에 따라 두 가지 기술 ( 즉, 부족한 조직의 양, 자원 또는 예기치 않은 실험 결과)을 사용하여 필요한 조직을 얻는 것이 항상 가능하지 않을 수도 있습니다. 우리의 경우, 유방 전체에서 이상이 관찰되었지만, 조직 병증대 측성 H &amp; E 글 랜드의 논리적 발견은 대체로 정상적이었다. 반대쪽 샘 사이의 압도적 인 불일치로 인해 우리는 전체 산에서 이상을 확인하는 경제적이며 효율적인 절차를 개발하게되었습니다. 변형 된 가공 및 삽입 절차를 사용하여 고품질의 H &amp; E로 염색 된 섹션을 파라핀 내장형 마운트에서 준비했습니다. 우리는이 프로토콜이 화학 물질 노출 효과를위한 강력한 탐지 도구가되어 실험실 간 비교를 향상시킬 수 있다고 생각합니다.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>mounting media for coverslipping whole mounts and H&amp;amp;E sections</td></tr><tr><td>Leica automated processor</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model # ST5020</td><td></td></tr><tr><td>HM 355S Automatic Microtome</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>905200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Leica Biosystems</td><td>EM-400</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus microscope slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>electrostatically charged</td></tr><tr><td>Fisher Finest 24x60x1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td>coverslips</td></tr><tr><td>Varistain Gemini ES Automatic slide stainer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78000014</td><td></td></tr><tr><td>Sta-On</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803107</td><td>liquid adhesive; used in water bath at sectioning</td></tr><tr><td>Modified Harris Hematoxylin 72711</td><td>Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific)</td><td>72711</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Carbonate</td><td>SkyTech Laboratories</td><td>LCQ500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>needed in Carnoy&#039;s fixative</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4440-04</td><td>needed in Carnoy&#039;s fixative</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505001050000</td><td>needed in Carnoy&#039;s fixative and washing slides</td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505011137320190</td><td></td></tr><tr><td>Carmine Alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022-25G</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7210-500G</td><td></td></tr><tr><td>Automation wash buffer, 20X</td><td>Biocare Medical</td><td>TWB945</td><td></td></tr></tbody></table>

sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification

정상적인 유선 분비는 환경 독성 물질 및 의약품에 노출되거나 호르몬에 과도하게 노출되거나 유전 적 변형이 일어날 수 있습니다. 유선 전체 마운트는 노출 후에 발생할 수있는 형태 학적 변화의 진행을 포착하기위한 저렴한 방법입니다. 그러나 비정상 성이 더 많이 발생하기 시작하는 나중의 삶에서,이 한 가지 방법에 대한 단독 신뢰가 항상 이상의 적절한 진단을 내리기에 충분한 정보를 제공하지 못할 수도 있습니다. 역사적으로, 화학 테스트 가이드 라인 연구에서 단일 유선이 부검시 제거되고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)으로 염색 된 섹션으로 준비됩니다. 반대쪽 유방 전체 수집 및 분석의 통합은 위음성 평가의 가능성을 줄입니다. 전체 마운트의 평가는 슬라이드에 하나 또는 두 개의 전체 유선이 존재하는 경우에 제한적이며 경우에 따라 전체 마운트에서 관찰 된 이상은 없습니다.t는 H &amp; E 섹션에서 균일하게 표현됩니다. 이 연구의 목표는 달리 덮어 버렸거나 진단하기 어려운 병변을 식별 할 수 있도록 coverslpped mammary 전체 마운트를 H &amp; E로 염색 된 절편으로 변환하기위한 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다. 여기서는 처음에 전체 마운트로 준비된 유선으로부터 고품질의 파라핀이 포함 된 H &amp; E 섹션을 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. H &amp; E 절단을 위해 의도적으로 준비된 조직과 비교하여, 전체 마운트는 조직 제거 및 처리를위한 추가 준비를 필요로합니다. 그러나이 방법은 일반적인 실험용 시약과 약간의 추가 시간이 필요하기 때문에 값이 싸다. 결과적으로,이 방법은 화학적 및 환경 적 노출로 인해 정상적인 유방 발달을 어떻게 변화시키고 유전 적 변형으로 인해 발생하는 변화를 디스플레이하는지에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.

이 방법은 유방 패드의 원래 대 측성 H &amp; E 섹션에 조직 학적 변화가 나타나지 않으면 놓치기 쉬운 진단을 돕는 데 효과적입니다. 그러나 결과는 조직 학적 평가를위한 조직 준비 과정뿐만 아니라 초기 전체 마운트 준비 과정에서주의를 기울이는 경우에만 유용합니다. 파라핀 삽입은 보호를 제공하고 장래의 절개를 위해 조직을 보존하는 데 도움이됩니다. <p class="jove...

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Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

우리는 성공적으로 슬라이드를 전체 마운트로 고정시킨 유방 조직을 조직 병리학 적 평가를 위해 성공적으로 제거, 가공, 절단 및 착색하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 생식 및 발달 테스트 지침 연구에서 유선 전체 마운트의 수집 및 평가를 촉진 할 수 있습니다.

병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.4K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill.  우리는 성공적으로 슬라이드를 전체 마운트로 고정시킨 유방 조직을 조직 병리학 적 평가를 위해 성공적으로 제거, 가공, 절단 및 착색하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 생식 및 발달 테스트 지침 연구에서 유선 전체 마운트의 수집 및 평가를 촉진 할 수 있습니다. 

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

전임상 마우스 모델에 대한 수술 절차 및 방법론<em&gt; 드 노보</em&gt; 유방암 전이

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

연구

암 연구학

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC)-derived extracellular vesicles can be isolated from NAMEC medium via differential ultracentrifugation. Based on their density, EVs can be purified via ultracentrifugation at 110,000 x g. The EV preparation from ultracentrifugation can be further separated using a continuous density gradient to prevent contamination with soluble proteins. The purified EVs can then be further evaluated using nanoparticle-tracking analysis, which measures the size and number of vesicles in the preparation. The extracellular vesicles with a size ranging from 50 to 150 nm are exosomes. The NAMEC-derived EVs/exosomes can be ingested by mammary epithelial cells, which can be measured by flow cytometry and confocal microscopy. Some mammary stem cell properties (e.g., mammary gland-forming ability) can be transferred from the stem-like NAMECs to mammary epithelial cells via the NAMEC-derived EVs/exosomes. Isolated primary EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells cannot form mammary glands after being transplanted into mouse fat pads, while EpCAMlo/CD49fhi basal mammary epithelial cells form mammary glands after transplantation. Uptake of NAMEC-derived EVs/exosomes by EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells allows them to generate mammary glands after being transplanted into fat pads. The EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells transfer mammary gland-forming ability to EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells.

This protocol describes methods for purifying, quantitating, and characterizing extracellular vesicles (EVs)/exosomes from non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cells and for using them to transfer mammary gland-forming ability to luminal mammary epithelial cells. EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells can transfer this cell property to cells that ingest the EVs/exosomes.

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

발생학

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

의학

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

내유 상피 이식 절차

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

생물학

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

쥐에서 유선의 형태론과 유방암 위험의 변화

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

3 차원 조직학 볼륨 및 마우스 유방 땀샘을 연구에의 응용의 재구성

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...