이 프로토콜은 종종 약하고 감지하기 어려운 CD4T 세포 응답을 연구할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 항원 프리젠 테이션에 관한 사전 지식없이 CD4T 세포의 검출, 열거 및 격리를 허용합니다. 주요 장점은 타입-1 당뇨병과 같은 자기 면역 조건과 관련되었던 아주 수시로 희소한 인구인 CD4T 세포의 분석입니다.
건강한 기증자로부터 말초 혈액 샘플을 얻으면, 50 밀리리터 튜브에서 밀도 그라데이션 배지의 15 밀리리터 를 통해 35 밀리리터의 혈액을 겹쳐지기 전에 PBS에서 적어도 1 대 2 비율로 혈액을 희석시하십시오. 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리하고 결과 상단 플라즈마 층의 약 20 밀리리터를 제거합니다. 그런 다음 적혈구 펠릿을 피하고 신선한 PBS에서 세포를 세 번 씻기 위해 주의를 기울이는 백혈구 층을 수집합니다.
계산 후, PBS 농도의 밀리리터 당 제6 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC에 10배씩 세포를 희석한다. 개별 10 밀리리터 튜브에 각 제어를 위한 300 마이크로리터의 세포를 추가합니다. PBS로 각 튜브를 토핑 한 후, 원심 분리에 의해 세포를 퇴적시키고 RP5 중간 농도의 밀리리터 당 여섯 번째 세포에 10 번 10에서 세포를 재중단.
그런 다음 제어당 100 마이크로리터의 셀을 96개의 웰 각각에 플레이트하여 100마이크로리터의 RP5 배지를 잘 함유하고 있다. 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 다음으로, 남은 PBMC를 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고 세포 현탁액 1밀리리터당 CFSE 작업 스톡 솔루션 1개를 튜브 측면에 추가합니다.
튜브를 여러 번 신속하게 반전하여 세포를 세포 배양 인큐베이터에 5분 동안 혼합하고 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, RP5 배지의 5 밀리리터로 반응을 체포하고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 펠릿을 신선한 RP5 배지의 밀리리터 당 10번에서 6번째 PBMC로 1회 다시 중단하고 항원당 10밀리리터 튜브에 1밀리리터의 세포를 첨가하여 테스트합니다.
그런 다음 96개의 웰 각각에 항원당 100마이크로리터를 첨가하여 100마이크로리터의 RP5 배지를 잘 함유하고 있으며, 이는 잘 희석된 이자항원으로 보충한다. 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 유동 세포 측정 분석을 위한 CD4+T 세포 집단을 염색하기 위해 배양의 끝에 각 웰에서 세포의 전체 부피를 개별 형광 활성화 세포 선별 또는 FACS 튜브로 전달한다.
0.1%의 태아 종아리 혈청 또는 FCS로 보충된 PBS의 1밀리리터로 각 샘플을 세척합니다. 적절한 항인간 CD4 항체에서 페탄을 재중단하여 100마이크로리터의 PBS 플러스 튜브당 FCS를 재차한다. 빛으로부터 보호되는 20분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면, 신선한 PBS+ 튜브당 FCS 1밀리리터로 샘플을 세척하고 100마이크로리터의 신선한 PBS 플러스 FCS로 펠릿을 재보종한다. 분석 직전에 각 튜브에 프로피듐 요오드 1 마이크로리터를 추가하여 죽은 세포를 배제할 수 있습니다. 전방 및 측면 분산 부위에 따라 림프구를 게이트합니다.
세포 세포를 제외하려면, 전방 분산 영역대 요오드 음성 세포를 게이트하고 비형광 세포에 대한 전압 기준선을 설정하기 위해 스테인드 드 된 세포를 사용합니다. CD4 항체 형광및 CFSE 신호에 대한 전압을 설정하여 형광 신호가 각각 1000 미만이되도록 합니다. 단일 색상 제어 CFSE 및 CD4 샘플을 사용하여 스테인드 셀로 설정된 전압을 사용하여 각 색상에 대한 양양성 형광 신호를 확인합니다.
CFSE 및 프로피듐 요오드제는 일부 스펙트럼 중복이 있기 때문에 CFSE만 샘플이 프로피듐 요오드 채널에서 신호를 생성하지 않을 때까지 CFSE 형광으로부터 요오드형 형광을 빼도록 보정을 조정한다. 모든 시료를 분석한 경우, 항원으로부터 분할된 세포의 수를 5000개의 분할된 세포로 나누어 항원 없이 배양한 세포로부터 5000개의 분리되지 않은 세포에 의해 분할된 세포 수를 분할하여 세포 분열 지수를 계산한다. 거의 모든 기증자는 기증자가 Tetanus 독소를 유용한 양성 대조군 항원으로 만드는 백신 접종되었기 때문에 시험관 내 자극 후에 Tetanus 독소에 강한 T 세포 반응을 보여줍니다.
그러나 자극되지 않은 PBMC에서 CD4+T 세포의 확산은 최소화됩니다. 인간 프로 인슐린 C-펩티드와 7일간의 자극 후, 프로 인슐린 C-펩타이드 특이CD4+T 세포는 타입-1 당뇨병을 가진 개인의 말초 혈액에서 검출될 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스 매트릭스 단백질로 자극된 PBMC는 또한 증식을 입증한다.
종합, 이러한 데이터는 분석이 짧은 합성 펩타이드뿐만 아니라 전체 길이 단백질을 사용하여 수행 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법의 FACS 구성 요소는 세포 분류 흐름 세포계를 사용하여 수행 될 수있다. 세포 선별기를 사용하여 항원 특이적 T 세포는 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 수준에서 격리될 수 있다.
이 방법은 초기 개시 타입-1 당뇨병을 가진 개별에 있는 CD4T 세포 반응의 발견을 허용했습니다. 다른 방법을 활용하는 이러한 희귀 한 T 세포 인구를 분석하는 것은 다양한 기술적 인 과제를 제시한다.
