이 방법을 사용하면 세포가 집합적으로 구성되는 방식을 조작하고 정량화할 수 있습니다. 이것은 우리가 생체 외에서 패턴을 모델링할 수 있고 생체 내에 단단히 결합된 디젠글링 큐를 모델링할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술은 최소한의 전문 장비가 필요하므로 표준 생물학 실험실에 설치될 수 있으며 정량적으로 하위 시각적 패턴 화 이벤트를 발견할 수 있습니다.
이 방법은 패터닝이 나타날 수 있는 모든 세포 시스템에 쉽게 적용될 수 있고 분화, 증식 및 세포 대 세포 경쟁의 무작위 패턴이 발견될 수 있습니다. 이 방법의 주요 새로운 세포 유형에 대 한 마이크로 패턴 매개 변수의 체계적인 최적화. 예를 들어 패턴 크기와 모양, 행렬 유형 및 셀 접착 시간.
장갑을 끼고 10센티미터 평방 페트리 접시 바닥에 실험실 필름 을 놓습니다. 12mm 홀 펀치를 사용하여 소수성 플라스틱 슬라이드를 잘라 12mm 주위 의 커버 슬립을 만들고 커버 슬립을 새로운 페트리 접시에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 커버 슬립에서 보호 필름을 조심스럽게 제거하십시오.
사진 마스크를 깨끗하고 안정적인 표면에 놓고 크롬 면을 위로 올려 놓고 원하는 칩 디자인의 위치에 이중 증류수 2 마이크로 리터 드롭을 추가하십시오. 커버 슬립을 드롭위에 부드럽게 누르고 홀더를 플라스틱 슬라이드 위에 놓습니다. 이 샌드위치를 클램프로 조심스럽게 고정하여 포토 마스크와 접촉하는 플라스틱 조각을 유지합니다.
10분 조명을 위해 광원에서 약 2센티미터 떨어진 자외선 오존 램프에 어셈블리를 배치합니다. 조명 기간이 끝나면 하단에 사진 마스크가 달린 샌드위치를 잡고 한 손으로 압력을 유지하면서 클램프를 조심스럽게 제거하여 샌드위치를 분해하는 동안 슬라이드가 움직이지 않도록 하십시오. 모든 클램프가 제거되면 홀더를 제거하고 모든 플라스틱 조각이 여전히 마스크에 붙어 있고 홀더에 달라붙지 않도록 주의하고, 칩에 이중 증류수를 추가하여 사진 마스크에서 칩을 부드럽게 분리합니다.
매트릭스 증착 챔버 내에 사진 패턴 칩을 배치하고, 조명된 측면을 위로 하고, 각 칩에 200 마이크로리터의 코팅 용액을 추가합니다. 그런 다음, 챔버에 이중 증류수로 채워진 3센티미터 페트리 접시를 추가하여 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 증발을 제한합니다. 칩에 배아 세포의 파종을 위해, 칩을 세척당 신선하고 멸균 된 PBS2개 이상의 세척으로 세척한 후, 각 칩에 적절한 세포 배양 배지의 200 마이크로리터에서 10배씩 분배한다.
그런 다음 시드 챔버를 닫습니다. 세포가 칩을 부착할 수 있도록 1시간 동안 배양합니다. 세포가 부착되면 멀티웰 플레이트의 우물을 웰당 500 마이크로리터의 따뜻한 배지로 채우고 멸균 핀셋을 사용하여 칩을 개별 플레이트 우물로 옮웁니다.
플레이트를 격렬하게 흔들어 부착되지 않은 세포를 분리하고 즉시 상복부을 신선하고 따뜻한 매체로 교체하십시오. 그런 다음 현미경아래에서 패터닝이 보이는지 관찰하십시오. 그들의 도금 후 48 시간, 세포는 엄격하게 패턴의 모양을 따르는 조밀 한 식민지를 형성한다.
칩을 플레이트에 넣고 칩이 건조되는 것을 방지하기에 충분한 매체를 제외한 모든 매체를 제거하고, 파라포름알데히드 또는 PFA 기반 고정 솔루션의 최소 500 마이크로리터를 잘 넣습니다. 10분 후, 세척 용액으로 우물을 세 번 간략하게 씻은 다음, 세척 용액에 희석된 50밀리알라 암모늄 염화암모늄으로 한 번 세척하여 잔여 PFA 교차 연결 활동을 담금질합니다. 마지막 세척 후, 적어도 30 분 동안 차단 용액으로 샘플을 처리합니다.
칩 배양을 면역염색하기 위해 칩을 염색 챔버 셀 측으로 옮기고 각 칩에 관심있는 1 차 항체 용액의 100 마이크로 리터를 즉시 추가하십시오. 실온에서 회전 플랫폼에서 1 시간 후, 입증 된 대로 세척 용액으로 칩을 세 번 세척하고 회전 플랫폼에서 1 시간 동안 적절한 이차 항체로 칩을 배양하십시오. 이차 항체 배큐어의 끝에서, 세척 용액에 칩을 세 번 세척하고 표준 장착 매체의 20 마이크로 리터와 현미경 슬라이드에 칩을 장착.
칩을 이미지화하려면 먼저 스캐닝 속도, 이미지 해상도, 프레임 평균 및 검출기 획득을 조정하여 이미지 품질과 이미징 시간 사이의 최적의 식별을 합니다. 그런 다음 각 칩의 이미지를 수집합니다. 모든 이미지를 획득하고, 설치 및 실행하면 온라인으로 사용할 수 있는 문서 다음에 PickCells를 설치하고 실행하면 새 실험을 만들고 이미지를 프로그램에 가져옵니다.
네시 모듈을 사용하여 핵 봉투 신호를 기반으로 핵을 분할합니다. 기본 세분화 모듈을 사용하여 패턴의 자동 형광 신호를 식별합니다. 그런 다음 완료를 클릭하고 모든 이미지가 처리 될 때까지 기다립니다.
핵 개체를 만들고 기본 개체 기능을 계산하려면 작업 표시줄에서 본질적인 기능 모듈을 실행하고 타원성 피터 및 표면 추출기 패널을 닫아 기본 기능 패널만 열어 두십시오. "핵"을 오브젝트 유형으로 선택하고 분할된 이미지에 대해 제공된 접두사를 선택합니다. 그런 다음 Compute"를 클릭하고 모든 이미지가 처리될 때까지 기다립니다.
이 단계에서, 추가 특징은 우리의 분석을 위한 데이터를 내보내기 전에 핵으로 기록될 필요가 있습니다. 예를 들어 각 핵이 핵 특성으로 속하는 이미지의 이름을 저장하려면 데이터"및 새 특성을 클릭하고 팝업 대화에서 핵을 선택합니다. 확인"노드에 연결된 다른 개체에서 데이터 수집을 선택"하고 다음을 클릭 "왼쪽 패널에서 이미지를 선택"과 두 번 클릭하여 이미지 노드를 경로의 대상으로 설정합니다.
감소 작업 창을 확장하고 하나를 가져옵니다"사용 가능한 특성 창을 확장하고 이름 특성을 선택합니다. 그런 다음 변경"과 다음"이미지 이름을 입력하고 탭 키를 누른 다음 완료를 클릭합니다"다음 탭 분리 된 값 파일로 데이터를 내보냅니다. 분석을 위해 내보낸 데이터를 R-Script 폴더의 데이터 폴더로 반복합니다.
스튜디오를 열고 빈 맵 템플릿 R-Script를 엽니다"그런 다음 작업 디렉토리를 소스 파일 위치로 설정하고 스크립트를 실행하여 밀도 맵을 생성합니다. 세포 파종 후 1 시간에서, 개별 세포 배양 패튼은 세포가 시간이 지남에 따라 증식으로 완전히 confluent되지 않을 수 있습니다. 그러나 패턴은 접착제 표면 외부의 셀만 거의 없는 것으로 완전히 식민지화됩니다.
시드 후 최대 2시간까지 명확하지 않은 패터닝은 절차의 실패를 나타냅니다. 큰 디스크 또는 링 미세 패턴에 마우스 배아 줄기 세포의 공간 감금은 중피 brachyury 마커를 표현하는 세포의 하위 집단의 패터칭을 안내한다. 예를 들어, 마우스 배아 줄기 세포가 큰 디스크 마이크로패턴에서 재배될 때, 브라추리 양성 세포는 국소 세포 밀도가 가장 낮은 패턴의 주변으로 우선적으로 제한됩니다.
이 패턴은 뇌 -brachyury 강도의지도에 의해 확인된다. 이러한 데이터는 하나의 콜로니의 검사가 관심 표현의 마커에서 공간 조직의 어떤 형태를 식별하기에 충분하지 않기 때문에 방법이 하위 시각적 정보를 나타낼 수 있음을 보여줍니다. 이것은 특히 중요한 식민지 대 식민지 변동성에 의해 설명된다.
이 기술은 또한 T 패터닝이 이 맥락에서 뼈 형태유전학 단백질 신호에 의해 구동되지 않는다는 것을 나타낼 수 있는 DNA 결합의 억제제에 대해 검출 가능한 패터닝이 존재하지 않는다는 것을 보여줍니다. 커버 슬립의 어느 쪽이 제거되고 코팅되었는지 항상 기억하고 또한 세포가 과잉 세포를 세척하기 전에 적절하게 부착되었는지 확인하십시오. 이 방법은 세포의 자기 조직을 안내하는 데 중요한 환경 단서를 연구할 수 있게 해주며, 또한 기본적인 패터닝 하에서 우리를 더 잘 돕는 수학 모델을 알릴 수 있습니다.
