우리는 그들의 기술 지원에 대 한 모나 쉬 Microimaging 감사합니다. 일부 변종 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 이 작품 모나 쉬 대학 의학 발견 친목, NHMRC 프로젝트 그랜트 (GNT1105374), NHMRC 수석 연구 친교 (GNT1137645)와 veski 혁신 친교에 의해 지원 되었다: 로저 Pocock VIF 23.

1. 준비 및 웜 농업
참고: 모든 제품 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
<ol><li>OP50 대장균 문화: Lysogeny 국물 (파운드) (1% tryptone 0.5% 효 모, 0.5 %NaCl, pH 7.0) 항생제 없이 37 ° C에서 하룻밤에 OP50 박테리아 문화.</li>
	<li>선 충 류 성장 미디어 (NGM) 판 (1.5 g의 NaCl, 한 천, 펩, 1 M CaCl2, 에탄올, 1 M MgSO4 의 1 mL에에서 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1.25 g의 8.5 g OP50 박테리아의 400 µ L 씨 고 1 M KPO4 버퍼의 25 mL)와 공기 건조 48 h에 대 한 박테리아.</li>
	<li>시드 NGM 접시에 벌레를 선택 하 고 15 ° C 또는 20 ° C에서 품 어<ol>
<li>성인 자웅 동체 생식의 분석을 위해 잘 먹이 L4 벌레 세균 잔디를 선택 하 고 20 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>광고에 나온 것에 정자 수를 점수, 12 h 20 ° C에서 L4 벌레 벌레 L4/성인 탈피에 도달할 때까지 품 어. 동기화 하려면 L4 단계에 벌레, 표 백제 솔루션 (1 M NaOH와 1:1 비율에서 표 백제) 계란의 많은 성인 벌레를 수확 하 여 계란을 준비 합니다. 계란 해치 고 L4 동물 실험에 대 한 선택 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드에서 폴 리-L-리 신 솔루션의 25 µ L를 놓고 피 펫 팁을 사용 하 여 솔루션 잘, 확산 테 플 론 현미경 슬라이드를 준비 합니다. 초과 폴 리-L-리 신 종이 타월로 제거 후 건조 한 공기를 품 어 15-20 분 동안 65 ° C에서 슬라이드 슬라이드 수 있습니다.</li>
</ol>2. 생식 해 부와 얼룩6,13
<ol><li>10 µ L 22 × 22mm coverslip에 0.01 %tetramisole (마 취)의 자리 고 그것으로 한-하루 오래 된 성인 벌레를 선택 합니다.</li>
	<li>(5 mL) 주사기 및 바늘 (24 "x 1")를 사용 하 여 진정 된다 그것으로 꼬리에 벌레를 해 부하 고는 생식 손상 되지 않은 확인 합니다. 주: 해 부 웜은 웜 및 웜 움직임에 부정적인 압력은 생식의 방출 원조를 마비 완전히 된다 전에 밖으로 실행 되어야 한다. 정자, 득점을 위한 해야 합니다 주의 spermatheca 손상 않기로 바늘에 의해 해 부 동안. spermatheca 후 절 개 포인트를 제외 하 고 바늘으로는 생식을 만지지 마십시오. 생식 구획에 휴식 또는 어떤 방전은 생식에서 관찰, 경우는 생식 분석을 위해 사용할 수 없습니다 한다.</li>
	<li>폴 리-L-리 신 코팅된 슬라이드, 슬라이드에 해 부 생식 유지에 거꾸로 coverslip를 놓습니다.</li>
	<li>1 분 빠르게 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 germlines와 함께 하는 coverslip 제거 위해 액체 질소에 coverslip, 다음 장소 슬라이드의 모서리에 종이 타워를 배치 하 여는 coverslip에서 과잉 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>슬라이드는 챔버에 30-60 s-20 ° C 메탄올으로 전송 다음 갓된 고정 솔루션 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 포함 0.08 M HEPES pH 6.9, 1.6 m m MgSO4, 0.8 m m 에틸렌 글리콜-bis(beta-aminoethyl x 1에서에서 30 분 동안 품 어 에테르)-N, N, N', N'-tetraacetic (EGTA), 산과 3.7 %paraformaldehyde) 실내 온도에.</li>
	<li>1 x PBS, pH 7.4 포함 된 챔버에 배치 하 여 슬라이드를 씻어 0.1 %10 분에 대 한 트윈-20이 단계를 반복이 한 번.</li>
	<li>차단 솔루션 차단 30 µ L로 germlines (염소 혈 청의 1700 µ L에서 염소 혈 청의 900 µ L을 추가 하 여 준비의 30 %h 조2O를 증 류와 10 x PBS의 300 µ L) 30 분 동안 실내 온도에 플라스틱 상자에 젖은 종이 수건을 배치 하 여 준비 하는 습 한 실에.</li>
	<li>REC-8 항 체 솔루션 각 샘플 비율 1:300에 30% 염소 혈 청에서 준비의 50 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	<li>슬라이드를 씻어 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 단계를 한 번 반복 하 고 슬라이드의 모서리에 종이 타월을 배치 하 여 과잉 액체를 제거.</li>
	<li>30% 정상 염소 혈 청에서 녹색 fluorophore (488 nm 방출 파장) 활용된 2 차 항 체 (1:1000), phalloidin (말라 얼룩, 1:4000), 및 (DNA 얼룩, 1:4000) DAPI를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>슬라이드에 이차 항 체 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>슬라이드를 씻어 두 번 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 초과 액체 닦아.</li>
	<li>고정 슬라이드에 시 약 30 µ L을 추가 하 고 1.5 µ m coverslip x 12 m m2 위에 놓고 하룻밤 4 ° C에서 슬라이드를 건조.</li>
</ol>3. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>Confocal 현미경, 레이저, 공명 스캐너 및 confocal 현미경 소프트웨어 설정. 63 X 목표 위에 슬라이드 홀더에 얼룩진된 germlines와 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>생식, 포커스는 생식 상단 찾아서 confocal 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 표시 합니다. 비슷하게는 생식의 하단에 집중 하 고 총 생식 두께 설정 표시.</li>
	<li>0.5 µ m. 마크 완전 한 생식 그리고 시작 인수까지 각 슬라이스의 두께 정의 하 여 전체 생식 이미지. 각 슬라이스 8 번 스캔 하 고 이미지 품질을 개선 하기 위해 값을 평균. 공명 스캐너 이미징 동안 표백 방지 하려면 빠른 검색 허용 됩니다. 만약 현미경 공명 스캐너, 표백을 피하기 위해 4 검사의 수를 줄일 수는 없습니다.</li>
</ol>4. 게시물 이미징 분석 핵의 수와 분포
참고: 소프트웨어 도구와 사용 하는 버튼의 스크린샷을 위한 보충 그림 1 을 참조 하십시오.
<ol><li>8.4.1 Imaris 또는 소프트웨어의 이미지를 가져옵니다.</li>
	<li>각 지역에서 핵 형태를 식별 하 여 mitotic 지역, 전이 영역, meiotic 지역, oocyte 지역, 그리고 spermatheca는 생식의 정의.</li>
	<li>소프트웨어의 표면 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 관심 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>자동 표면 생성 마법사를 취소 하 고 수동으로 3 차원 스택에서 이미지의 첫 번째 및 마지막 조각에서 관심 영역을 그립니다.</li>
	<li>만들기 화면을 클릭 합니다. 참고: 소프트웨어를 자동으로 첫 번째 및 마지막 스택 간의 스택을 개발할 것입니다.</li>
	<li>DAPI 제외 하 고 모든 채널 마스크 채널 버튼 (보충 그림 1B-C)를 클릭 하 여 마스크.</li>
	<li>자리 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 핵 크기 매개 변수를 정의 합니다. Mitotic 지역에 대 한 Z 직경 정의 하면서 2 µ m의 XY 직경을 정의 합니다. 전환 영역에 대 한로 1.5 µ m. (보충 그림 1D) 2 µ m의 XY 직경 및 Z 직경을 정의 합니다. 참고: 확대 및 현미경의 사양에 따라 직경을 해결 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 사용 하는 목적은 63 X 되었고 추가 이미징 동안 1.70 배 확대를 제공. 목표 변경, 예를 들어 40 X, 직경 적절 하 게 변경 한다. 올바른 매개 변수를 설정 하려면 wildtype germlines와 문제 해결을 수행 합니다. 야생 유형 생식 팔의 mitotic 지역은 약 250 핵 있다. 지름이이 값을 달성 하도록 수정 한다. 적어도 15 germlines를 사용 하 여 직경에 대 한 최적의 값을 확인 하. 이와 비슷한 방식은 전환 영역 (150-170 핵)와 meiotic 지역 (600-700 핵) 보정을 위해 사용 되어야 한다.</li>
	<li>최소 임계값 (보충 그림 1E)를 정의 하 여 관광 명소의 검색을 제한 합니다. DAPI를 사용 하 여 첫 번째 자리는 생식 외부 표시 될 때까지 최소 3 차원 렌더링 임계값을 늘려 최소 임계값을 설정 하는 야생 타입 germlines 스테인드.</li>
	<li>이미지를 저장 하 고 소프트웨어에 의해 자동으로 생성 하는 테이블에서 핵의 수를 얻을. TIF 파일로 이미지를 내보냅니다.</li>
</ol>5. 게시물 점수 정자 염색체 수에 대 한 분석 영상
<ol><li>관심 영역으로는 spermatheca를 선택 하 여 3 차원 렌더링을 수행 합니다. 각 정자를 감지, 0.75-사이 반점 직경 정의 1.0 µ m x 및 Y 축, Z 지름은 정의 되지 않은 유지 하는 동안. 관광 명소 기능 버튼을 사용 하 여 보충 그림 1에서 보듯이.</li>
	<li>백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여. 참고: Imaris 소프트웨어 추천 강도 높은 포인트 먼저, 따라서 배경 효과 최소한의 상당한 차이가 관심 영역 및 배경으로. 두 번째 방법은 이다 배경에 대 한 배경 보정을 수동으로 정의 적절 한 값을 지정할 수 있습니다. 수동 배경 교정 독립적인 샘플의 강도 비교를 요구 하는 경우 적절 한 될 것입니다.</li>
	<li>Spermatheca (보충 그림 1E)에서 모든 DAPI 스테인드 정자를 검출 하기 위하여 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>염색체, 계산에 대 한 정의 자리 직경 < x 0.75 µ m 및 Y-축 3 차원 모델을 개발 하기 전에.</li>
	<li>이미지를 저장 하 고 TIF 파일로 내보내기.</li>
</ol>6. 포스트는 생식의 Cytoskeletal 재건에 대 한 분석 영상
<ol><li>생식에 관심 영역을 식별 하 고 phalloidin 제외 하 고 모든 채널을 채널 마스크 버튼을 클릭 하 여 마스크.</li>
	<li>표면 기능 버튼 (보충 그림 1)를 사용 하 여 0.25 µ m의 표면 세부 정보를 정의 합니다. 참고:이 모든 0.25 µ m으로 3 차원 모델 렌더링 됩니다 의미 합니다. 표면 디테일 3 차원 표면 모델 마다 0.25 µ m에 대 한 생성 하는 것입니다 어디는 생식의 모든 지역에 대 한 일정 수 있습니다. 그러나, oocyte 지역에 대 한 표면 세부 수 수 증가 0.35-0.5 µ m이이 지역에서 잘 정의 된 걸 섬유의 존재 때문.</li>
	<li>백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여.</li>
	<li>분석 (보충 그림 1E)을 필요로 하는 구조에 따라 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>개발 된 3 차원 이미지를 저장 하 고는 TIF 파일로 내보내기.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress.">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).</li><li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+control+of+germline+development.">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li><li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. 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R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-1,+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation,+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li><li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development.">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li><li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans.">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li><li>Berry, L. 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M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li><li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction.">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li><li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li><li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S6K+links+cell+fate,+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li><li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes.">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).</li></ol>

저자는 관심의 충돌을 선언합니다.

이 프로토콜의 목표는 정확도 개선 하 고 생식 분석에 필요한 시간을 줄일 것입니다. 준비 후에 표준 해 부 germlines의, 생식 핵의 3 차원 모델 렌더링 계산에 의해 준비 된다. 공간에 생식 핵 분포의 관찰 하면서 3 차원 렌더링은 생식의 특정 지역에서 핵의 수를 계산 합니다. 우리의 방법의 중요 한 측면 핵의 크기와 모양 매개 변수의 정확한 정의 이다. 이 얼룩이 지 고 사용 확대의 선명도에 따라 이미지를. 우리는 게시 된 데이터를 수동으로 분석1에 비교 하 여 방법의 정확성을 확인 했다. 더욱 우리의 방법의 정확도 확인, 우리 다른 조건 하에서 여러 돌연변이 사용 하 고 게시 된 문학으로 결과 확인. 그것은 또한 미묘 하 고 강한 고기-감지 하는 방법의 능력을 확인 cpb-3 및 glp-1 돌연변이, 각각. 또한,이 방법은 핵 크기와 형태는 생식 또는 심지어 긴장 사이 변화에 적응력을 보여줍니다. 이 속성은 또한 id 및 염색체와 정자 등 생식에 작은 구조의 득점 수 있습니다. 필요한 경우는 메서드 또한 크기와 모양 매개 변수에 대 한 문제 해결, 수 있습니다. 우리의 분석 수 핵은 생식에의 분포를 명료 하 고 보여주었다 핵 mitotic 그리고 pachytene 지역 다른 패턴으로 구성 됩니다. REC-8와 DAPI 얼룩 3 차원 렌더링을 적용 하 여 우리 또한 mitotic 영역의 핵 내에서 REC-8의 분포를 보였다.
말라 얼룩의 3 차원 렌더링 생식 cytoskeletal 구조의 상세한 검사를 사용할 수 있습니다. 그들은 신체 접촉을 유지는 생식 두 개의 별도 걸 구조를 나타납니다. 최상의 결과 얻으려면 관심 영역은에 mitotic 미리 선택 하는 경우 얻을 수 있습니다, 전환, 전체 생식에 대 한 골격의 재건은 단일 엔터티로 가능, meiotic 지역. 원심 생식 골격은 정의 되지 않은 모양을 있으며 인접 끝 filamentous 구조 진화. 따라서 우리의 프로토콜 말라 분포에 차이 수용 하기 위해 특정 매개 변수를 정의 하 여 생식 말라 골격의 3 차원 재구성을 수 있습니다. 분석의 가장 중요 한 측면은 핵 크기와 표면 세부 사항 요구 등 매개 변수 정의입니다. 실제 크기 아래 핵 크기를 낮추는 별도 개체로 핵 내에서 밝은 반점 선택 소프트웨어를 위험 것입니다. 마찬가지로, 높은 표면 세부 값의 정확한 3 차원 구조 손실 이어질 것입니다. 제안된 된 방법의 해 부 및 생식 얼룩의 품질 정밀도에 의존합니다. 손상 된 생식 핵의 릴리스 부정확 한 번호 매기기 일으키는 생식에서 발생할 수 있습니다. 얼룩에서 높은 배경 또한 부정확 한 핵 수와 부적 절 한 3 차원 렌더링 될 수 있습니다.
우리의 방법은 우리가 핵 번호와 유통/식 단일 프로토콜20공간에서 생식 단백질의 분석 수 있는 생식 분석의 이전에 알려진된 자동화 된 방법을 확장 합니다. 둘째, 우리의 메서드는 더 작은 구조는 생식 내 염색체 등의 득점 수 있습니다. 염색체 분리 oocyte 개발21의 중요 한 측면입니다. 우리의 방법을 사용 하 여, 번호와 어디 거리는 야생 타입 oocytes에 대 한 보정에 의해 정의 될 수 있습니다 염색체의 위치 검출 가능 하다. 이 도구를 사용 하 여 염색체 분리에 영향을 미치는 모든 돌연변이 공부 될 수 있다. 또한, 2 세포 단계에서 태아에서 염색체를 연구 메서드를 확장할 수 있습니다. 계산 분석 또한 cytoskeletal 구조를 spermatheca, oocyte 생식에서 염색체의 수에에서는 정자의 수를 제공합니다. 함께 찍은, 방법은 단일 프로토콜을 사용 하 여 분석 시간을 상당히 줄이면서 C. 선 충 생식의 포괄적인 분석을 제공 합니다. 메서드를 각 분석 (핵 수, 단백질 분포, 및 cytoskeletal 구조)에 대 한 여러 도구의 요구 사항을 제거 하 고 어떤 특정 소프트웨어에 필요한 코딩 시간을 제거 합니다. 마지막으로,이 방법은 진정 살아있는 벌레의 3 차원 분석을 포함 한 다른 웜 연구를 효과적으로 확장할 수 있습니다.

포유류와 경로 신호의 보존은 C. 선 충 여러 생물 학적 과정1,2를 공부 하는 우수한 모델. 우리의 실험실 사용 하 여 선 충 C. 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 유전자 발현 연구. 생식은 3 차원 구조, 많은 학문은 2 차원 3 차원 분석의 시간과 노동 집약적인 특성상. 2 차원 분석 vivo에서 이벤트는 생식에 허위로 수 있습니다 매우 높습니다. C. 선 충 성인 남녀 추 니 두 생식 팔, 각각의 집 체세포 원심 끝 셀 (DTC)는 미 분화 상태3,4원심 세균 세포를 유지 하는. 이 세균 세포 차별화 영향력, 탈출 DTC에서 이동 하는 시작 되 고 해지고 oocytes 정자로는 생식의 근 위 끝에 도달. 이 과정 동안, 생식 세포 핵 유사 분열, 감수 분열5,6에 전환 하기 전에 받아야. 정자 생산 후 oocytes는 성인 기 동안 생산 개발의 애벌레 단계 4 (L4)에 의해 완료 된다. 정자는 어디 그들은 비 옥 하 게 배아를 생성 하기 위해 oocytes spermatheca에 저장 됩니다.
핵의 수, apoptotic 이벤트, 염색체 역학, 고 단백질 식 및 지역화7 수에 변화 결과로 C. 선 충 에서 생식 개발에 영향을 미칠 수 있는 여러 유전과 환경 요인이 있다 ,,89,,1011. 이러한 이벤트의 분석 핵 형태와 분포에 따라 차별화의 각 단계의 식별을 해야 합니다. 큰 샘플 크기와 수동으로 이러한 매개 변수를 정확 하 게 분석 이며 노동 집약적인 시간이 걸리는. 이러한 단점을 우회 하 고 분석의 일관성 있도록, 우리 세 핵, 핵 배포, 단백질 표정, 선 충 C. 생식의 3 차원 검사를 위한 자동화 된 방법을 개발 및 cytoskeletal 구조입니다. 3 차원 렌더링 confocal 현미경 검사 법을 결합 하 여 세균 세포 분화의 단계 각의 식별에 대 한 크기와 모양 매개 변수를 생성 했습니다. 또한,이 메서드는 생식 세포 핵과 정자의 세 플러스 각 oocyte에서 염색체 수의 득점 수 있습니다.
1 개의 중요 한 구조는 생식 생식 구획, 에이즈 세포질 스트리밍 및 생식 핵12보호 안정성을 제공 하는 골격 이다. 전산 렌더링을 사용 하 여, 우리는 생식 세포 골격의 3 차원 재구성을 수행 하 고 뚜렷한 cytoskeletal는 생식 기능을 식별. 여기, 우리가 어떻게 계산 분석 confocal 이미징 수 있도록 포괄적인 분석 C. 선 충 생식의 결합을 설명 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.
C. 선 충 의 생식 (그림 1)의 3 차원 분석을 위한 빠른 방법을 제안 한다. 3 차원 분석을 사용 하 여, 그것은 셀 (그림 2), 생식 세포 골격 ( 의 개조의 자동화 (그림 2 및 그림 3), 생식 핵의 3 차원 분포 계산 공부 가능 그림 3), 단백질 (그림 4), 그리고 점수는 spermatheca에 정자와 oocytes (그림 5)에서 염색체의 수의. 메서드는 생식의 쉽고 정확한 정량화를 가능 하 게 뿐만 아니라 생리 적으로 관련 된 고기를 식별.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="934">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OP50 Escherichia coli bacteria</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nematode Growth Media (NGM) plates</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyclonal rabbit anti-REC-8&#160;</td>
			<td>SDIX</td>
			<td>29470002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 conjugated antibody raised in goat</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytoskeletal dye phalloidin&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:168px;">A-12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M HEPES buffer, pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">G0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040031000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroshield fixing reagent&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>1009832511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20&#176;C &#38; 25&#176;CIncubator&#160;</td>
			<td>Any brand</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td style="width:264px;">Any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Any brand (Leica, Zeiss)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.</td>
			<td style="width:264px;">Bitplane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Phospho buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:264px;">Homemade</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Tekdon&#160;</td>
			<td style="width:168px;">&#160;941-322-8288</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton

꼬마 선 충 (C. 선 충) 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 및 염색체 역학을 포함 하 여 몇몇 생물학으로 중요 한 과정을 공부 하는 데 사용 됩니다. 동안에 생식은 우수한 모델, 분석은 종종 2 시간 및 3 차원 분석에 필요한 노동 차원. 이러한 연구에 주요 정보는 핵 및 단백질 분포는 생식 내 번호/위치. 여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 전산 접근을 사용 하 여 수는 생식의 각 지역에서 핵의 위치를 결정 하는 생식의 자동화 된 분석을 수행 하는 방법을 제시. 우리의 방법은 또한 다른 유전 배경의 단백질 식의 3 차원 검사를 가능 하 게 생식 단백질 분포를 분석 합니다. 또한, 우리의 연구는 특정 공간 발달 요구를 수용할 수 있는 생식의 고유 영역에서 cytoskeletal 건축에 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 우리의 메서드는 각 생식의 spermatheca에 정자의 자동화 된 계산 수 있습니다. 함께 찍은, 우리의 메서드는 C. 선 충 생식의 신속 하 고 재현성 phenotypic 분석을 수 있습니다.

그림 1 3 차원 생식 분석에 필요한 시간을 나타냅니다. 20 ° C에서 incubated L4 광고에 나온 것 germlines를 분리 해 부 되었고 DAPI, phalloidin, 및 생식 단백질에 대 한 항 체와 스테인드. Germlines는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 얼룩 그리고 confocal 현미경 검사 법 완전 한 생식 필요 수 핵의 위치를 계산, 단백질 분포를 식별, 분석 cytoskeletal 구조와 점수를 10-15 분 약 24 h. 전산 분석 필요는 정자의 수입니다. 완전 한 수동 분석 생식 당 2 시간 이상 필요 연산자 영향에 따라, 따라서, 자동화 된 우리의 높은 처리량 방법 분석 시간 단축 및 재현성을 향상 시킵니다.
자동 핵 생식 팔 집 약 1000-1200 핵 (그림 2C) 수동으로 이전 게시 데이터1점수 잘 대응 밝혀 득점. 득점의 정확도, 여러 돌연변이 다른 조건 확인 (그림 2D-G)을 사용 합니다. 예를 들어, 우리는 rnp-8(tm435), cpb-3(bt17), 및 glp-1(e2141) 돌연변이 웜 야생 타입 동물에 비교. 자동 계산 cpb 3 및 glp-1 돌연변이 germlines14,15,,1617핵의 수의 알려진된 감소 재현. 핵 수에 심각한 감소 또한 25 ° c.에서 알을 품을 때 glp-1(e2141) 온도 민감한 돌연변이에서 관찰 되었다 핵의 분포는 분화의 단계에 따라. 야생 타입에 약 250 핵 포함, mitotic 지역 핵 생식 (그림 3)1의 나머지 부분에 비해로 단단히 포장입니다. Mitotic 핵 사이의 간격이 최소 이며 핵 mitotic 지역에 걸쳐 위치 하 고 있습니다. 그러나, 핵 원심 끝에서 이동, 그들은 생식 (그림 3)의 원주 쪽으로 더 많은 나타납니다. 유통에서 변화 전환 영역에서 시작 하 고 핵 감수 분열/pachytene를 입력 완료.
생식 차별화의 여러 단계에서 특정 cytoskeletal 구조를 하고있다. 우리는 phalloidin와 생식을 얼룩에 의해 F-말라 시각. 생식의 근 위 끝에는 원심에서 F-말라의 분포 (그림 3 과 그림 5) 각 지역에서 별개 했다. 일반적으로, 두 개의 별도 구조 '실린더 내의 실린더.'로 표시 되는 Mitotic 지역에서 내부 걸 특정 모양 (그림 3)와 단단한 질량으로 나타납니다. 생식 전환 영역에 도달, 안 걸 더 원통형 구조를 가정 하 고 늦은 pachytene에 도달 하면 빈 실린더 된다. 걸의 두 번째 레이어는 생식에 모양을 주는 내부 레이어를 다루고 있습니다. 이 '실린더 내의 실린더' 말라 구조 oocyte 지역 (그림 5) 쪽으로 사라집니다. Oocyte 지역에서 말라 두꺼운 섬유도 나타납니다. oocytes는 spermatheca에 oocytes의 움직임을 허용 하도록 동적 것 처럼만 걸 rachis로 구분 됩니다. 마지막으로,는 spermatheca에 말라도 말라 섬유의 두꺼운 뭉치를 형성 한다. 그러나 섬유 포장에 표시 하는, oocyte 영역에 보다 가까이. Cytoskeletal 구조는 (그림 3) 핵의 분포 패턴을 보완 하기 위해 나타납니다. Mitotic 지역에서 핵 내부 말라 구조 배치를 나타납니다. 그들은 감수 분열/pachytene 도달, 생식 핵 (그림 3) 없는 대부분의 중간을 떠나 두 걸 실린더 사이 핵 구성 합니다. 이 생식에 중단 세포질 스트리밍 지원 아마 수 있습니다. Germlines는 REC-8 단백질에 대 한 항 체로 얼룩진 고 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석. REC-8는 생식의 초기 핵 주위 균질 분산 그리고 나중 죽 습 이며 감수 분열18동안 저하. 생식의 3 차원 횡단면 분석에서 REC-8 배포 mitotic 지역 (그림 4)에 단백질의 분포를 보여 줍니다.
생식의 근 위 끝의 3 차원 렌더링에 spermatheca 처음 세 oocytes는 spermatheca 원심 포함 됩니다. 우리의 분석 인식 각 spermatheca 151 정자의 평균 (n = 18). 이 방법 (그림 5F)19의 신뢰성을 나타내는 게시 된 문학에 해당 합니다. 이 분석은 cytoskeletal 함께 수행할 수 있습니다 또는 단백질 분포 연구. C. 선 충 게놈 6 염색체 분산 됩니다. 완전 개발된 야생 타입 oocytes에서 이러한 염색체 표시 되 고 계산 하실 수 있습니다. 이 염색체 분리 염색체 안정성 또는 다른 결함 oocyte 개발과 관련 된 연구를 사용할 수 있습니다. 3 차원 렌더링, 염색체의 수는 구상 될 수 있다, 그리고 염색체가 제대로 분리 되어, 경우 수 정확 하 게는 얻어질 수 있다 (그림 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig1.jpg"> 그림 1 . 자동화 된 분석에 대 한 타임 라인. C. 선 충 생식의 수동 및 전산 분석 사이 시간 비교. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig2.jpg"> 그림 2 . 핵은 생식에 분포. (A) DAPI 스테인드 mitotic 보여주는 생식, 전환, 및 pachytene/meiotic 지역. (B) 계산는 생식의 3 차원 모델. (C) 야생 타입 germlines에서 핵의 총 수에 대 한 점수. (D-F) 핵의 수에 대 한 점수 mitotic, 전환, 및 야생 유형, rnp-8, cpb-3, 및 glp-1 돌연변이 germlines의 meiotic 지역. (G) 20 ° C와 25 ° C에서 glp-1 돌연변이에 핵의 총 수에 비교 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 학생의 테스트입니다. n < 0.0001, * * *n < 0.001, * *n < 0.01, *n < 0.05. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig3.jpg"> 그림 3 . Cytoskeletal 구조는 생식의. (A-B) Mitotic 지역에 생식의 내부 걸 (레드) 골격의 조직. 안 말라 mitotic 지역에서 외부 걸에 비해 확산 구조를 하고있다. (C-D) Pachytene 지역에서 골격 (파란색) 핵 구성 되는 2 개의 실린더를 형성 하 여 원통형 구조를 가정 합니다. (E-F) 생식 핵 mitotic 그리고 pachytene 지역에서의 조직. 핵의 분포는 더 mitotic 지역 (녹색)에 비해 pachytene 지역에서 'germtube'의 둘레는 생식의 중간 핵 없는 되 고. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig4.jpg"> 그림 4 . REC-8 식 mitotic 지역에서. (A) 현미경 사진 REC 8 스테인드 생식의 선단부를 보여주는. (B-C) REC-8 얼룩 (파란색으로 표시)와 mitotic 핵 (녹색) 사이 단백질의 3 차원 렌더링. REC-8 착 색이 덜 풍부 (핵을 대표 하는 하얀 점으로 표시) mitotic 지역에 인접. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57702/57702fig5.jpg"> 그림 5 . 근 위 끝에 생식 구조. (A) DAPI 인접 끝에 생식의 얼룩. (B) 3 차원 렌더링 DAPI spermatheca (노란색)에서 보여주는 정자와 oocytes (흰색)에서 염색체 얼룩이 지기. (C-E) 3 차원 cytoskeletal 구조는 생식의 근 위 끝에. 레드 완전 한 근 위 끝을 표시 하 고 녹색 표시는 spermatheca. 교차 단면 분석 골격 뿐만 아니라의 oocytes, 주위 걸 filamentous 구조를 형성 하지만 oocytes 사이 분리도 보여줍니다. (F) 각 spermatheca에 여러 spermatheca에서 얻은 평균 정자의 수를 보여주는 그래프 (n = 18). 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/57702/57702supfig1.jpg"> 보충 그림 1 . 소프트웨어 도구 설명. (A)는 관광 명소 및 핵 및 단백질 얼룩을 탐지 하기 위한 표면 도구입니다. (B-C) 3 차원 지구의 표면 도구를 사용 하 여 관심사의 선택. (D) XY-직경, 핵 탐지에 대 한 명소 도구를 사용 하 여 정의 합니다. 관심 및 얼룩의 지역에 따라 z 축 직경 및 배경 보정을 사용할 수 있습니다. (E) 최소 및 최대 강도 임계값 검출 이와 비슷한 방식을 대신 사용할 수 있습니다 표면 기능에 대 한 어디 직경, 정의 그리고 표면 세부 정보를 정의할 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57702/57702supfig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

6.2K 조회수.  Monash University. 우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

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Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

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Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

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Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

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The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

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Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

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Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...