저자는 Thermo-Fisher Scientific의 후원을 인정하고 공 촛점 이미지 수집 중 지원을 위해 Kings College London의 Nikon Imaging Center에 감사드립니다.

모든 동물 실험은 지역 윤리 승인을 받아야하며 영국 정부 본국 면허 조건에 따라 수행되었습니다. 1. 피부 수확 및 냉동 보존 <ol><li> 준비. <ol><li> 1 % 인산 버퍼 식염수 (PBS) 25 ML와 4 % PFA 및 두 100mm 문화 요리 25 ML와 하나의 100mm 문화 요리를 준비합니다. </li><li> 최적의 절삭 온도 컴파운드 (OCT)로 직사각형 껍질을 벗기는 초저온을 3 분의 2까지 채 웁니다. </li><li> 저온 냉각 장치가 나중에 배치 될 수있는 금속 플레이트를 -80 ° C의 냉동 장치에 놓습니다. </li></ol></li><li> 피부 수확, 고정 및 냉동 보존. <ol><li> 마른 전기 면도기로 동물 시체의 등쪽 부위를 자릅니다. 참고 :이 예제에서는 출생 후의 21 일 야생형 마우스를 사용했습니다. </li><li> 피부에 관심있는 부위를 수확하십시오. 참고 : 마우스 피부의 등쪽 부위 ( <stron그림 1a)에는 균등하게 간격을두고 정렬 된 모낭의 비율이 가장 높으므로 절편을위한 최적의 방향이 있습니다. 피부가 아닌 조직의 제거는 필요하지 않지만 필요한 경우 수행 할 수 있습니다. </li><li> 수확 한 피부를 냉동 크기의 바닥에 맞게 적당한 크기의 직사각형 조각으로 잘라내어 모근 입자의 방향 성장을 고려하십시오. 주 : 초소형 스킨 슬라이스는 초보자가 다루기가 쉽기 때문에 인큐베이터 및 장착 과정에서 뒤죽박죽이 될 가능성이 적습니다. 여기에 표시된 예제는 ~ 1cm 2 의 등 지느러미 영역으로, 22 x 30 x 20 mm의 청색 결정 ( 그림 2a )에 들어 있습니다. </li><li> 피부 샘플 ( 그림 1b )의 두께에 따라 10-30 분 동안 4 % PFA 25 ML에 실온에서 피부를 고정. </li><li> 25 mL의 PBS로 2 번 피부 샘플을 씻으십시오.각각 최소 5 분 동안 ( 그림 1b ). </li><li> 종이 타올에 스킨 샘플을 담가서 과도한 PBS 조직을 조심스럽게 배수하십시오. 그러면 얼어 붙는 과정에서 결정화를 일으킬 수 있으며 cryosectioning 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 참고 : 표준 자당 기울기가 필요하지 않습니다. 그러나 이는 사용자의 재량에 따라 프로토콜에 통합 될 수도 있습니다. </li><li> 각 피부 샘플에 대한 모낭의 방향을 알고 있어야합니다. 시각 보조를 위해 해부 현미경을 사용하십시오 (특히 프로토콜을 처음 수행하는 사람). 피부 샘플을 OCT로 채워진 크라이 놀드에 넣고 포셉을 사용하여 잘린 머리카락의 표면에 부착 된 기포를 제거하여 피부의 모든 부위를 OCT로 평형시킵니다 ( 그림 2a 및 2b ). </li><li> OCT가 채워진 블록의 바닥에 피부를 밀어서 바닥과 평평하게 놓습니다. 참고 : 피부는 어떤 방향으로도 배향 될 수 있습니다.머리카락의 알갱이가 적절한 절단 과정에 대해 언급되는 한 오래 지속됩니다. cryosolding은 블록이 cryosectioning을 위해 cryostat에 부착 될 때 방향이 바뀔 것이다. 이 단계는 저온 유지 장치 절단의 후속 방향을 결정하기 때문에 냉동 표준에서 모낭의 방향을 표시하십시오. </li><li> 조직의 부동 및 탈락을 피하기 위해 -80 ° C의 냉동고에있는 금속판에 저온 차단 장치를 옮기십시오. </li><li> 보이지 않는 공기 방울이 피부가 초저온 물체의 표면으로 올라갈 수 있으므로 냉동 과정을 모니터링하여 초저온의 바닥에있는 피부의 방향을 유지합니다. 참고 : 냉동 조직이있는 Cryomold는 -80 ° C에서 1 년 이상 보관할 수 있으며 추가 섹션을 위해 재사용 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> 그림 1. 마우스 스킨 수집 및 고정. </strong&gt; ( a ) 동물 시체의 등쪽 부위에서 피부 조직을 수확했다. 이 영역의 모낭은 균등하게 간격을두고 배열되어 있으며 따라서 화살표로 표시된 바와 같이 절단 중에 최적의 방향을 허용합니다. ( b ) 크리오 몰드에 맞는 적절한 크기의 사각형을 절단 한 후, 피부 조직을 4 % PFA에서 15 분간 고정시키고 각각 5 분 동안 PBS로 2 회 세척 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 두꺼운 조직 횡단면 <ol><li> 저온 유지 장치에 장착 할 준비 및 조직 방향. <ol><li> 15 ML의 PBS와 100mm 문화 요리를 준비합니다. 저온 저장 장치에 쉽게 접근 할 수있는 곳에 놓으십시오. 또한, 웰당 2.5 ML의 PBS와 12 잘 접시를 준비; se의 장기 보관을위한 샘플에 따른 라벨4 ℃에서. 포셉을 사용하여 섹션을 처리하십시오. </li><li> -20 ° C에 저온 유지 장치의 온도를 조정하십시오. 참고 : 온도는 절단에 영향을 줄 수 있지만 -20 ° C에서 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 두 개의 모낭이 두꺼운 섹션을 얻으려면 절편을 150 μm 두께로 자르십시오. 참고 : 섹션의 두께는 사용자의 요구와 분석에 사용되는 현미경의 한계에 따라 달라질 수 있습니다. 참고 : 샘플의 방향은 모발이 적절한 방향으로 피부 절편을 얻는 데 중요합니다. 이것은 저온 유지 장치 블록에 올바르게 장착하여 이루어집니다. 단면 평면이 모낭의 방향과 평행한지 확인하십시오 ( 그림 2c ). 이전에 언급했듯이 스킨 샘플에서 단면 평면의 정확한 방향은 이미지의 품질을 결정하는 중요한 단계입니다.나중 단계. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> 그림 2. Embedding, cryopreservation 및 sectioning. ( a ) 흑색 화살표로 표시된 크리오 몰드에서 머리 여포 (HF) 방향을 표시하는 것은 cryosectioning 동안 적절한 방향에 중요합니다. ( b ) 단면 모서리는 모낭의 전체 길이가 그대로 유지되는 섹션을 생성하기 위해 모낭 오리 엔테이션과 정렬해야합니다. ( c ) 섹션은 모낭의 방향에 따라 검은 모서리 방향으로 절단되었습니다 냉동고. ( d ) 두꺼운 조직 단면을 금속 집게로 수집하고 ( e ) 1x PBS가 들어있는 100mm 배양 접시에 옮겼다. ( f ) 실온에서, PBS는 OC를 용해시킨다.티. 흰색 화살표로 표시된 것처럼 두꺼운 조직 단면을 둘러싸는 화합물. 섹션은 PBS에서 자유롭게 부유됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="2"><li> Cryosectioning. <ol><li> 저온 유지 장치를 사용하여 섹션을 자르십시오. 삽입 된 피부 조각을 포함하는 OCT를 집게를 사용하여 집게를 사용하십시오 ( 그림 2d ). 참고 : 최적의 시편 포지셔닝을 위해 X, Y 및 Z 축을 따라 독립적으로 이동하고 조정할 수있는 저온 유지 장치를 사용하십시오. 이를 통해 이상적으로 정렬 된 조직 단면을 생성 할 수 있습니다. </li><li> PBS로 채워진 100mm 문화 접시에 저온 저장 장치에서 절편을 옮기고 다음 조각을 계속합니다. 슬라이드에 샘플을 채취하지 마십시오 ( 그림 2e ). 참고 : 실온에서 PBS는 용해됩니다OCT는 포셉으로 다루기 쉬운 피부 조각을 남겨 둡니다 ( 그림 2f ). 참고 : 100 μm 두께의 많은 조직 절편을 용해한 후 100 mm 배양 접시에 신선한 PBS가 필요할 수 있으므로 그에 따라 변경할 수 있습니다. </li><li> 겸자를 사용하여 2.5 ML의 PBS ( 그림 3a , 왼쪽)로 가득 12 잘 접시에 올바르게 표시된 우물로 이동 피부 섹션을 전송합니다. 참고 : 4 ° C에서 샘플을 최소 2 일 동안 보관할 수 있습니다. 절단 후 피부를 함유 한 OCT 블록을 장기간 보관하려면 신선한 OCT 액 적을 사용하여 절단 표면을 밀봉하십시오. OCT 액 적의 냉동 후 사용 된 OCT 블록을 파라 필름에 싸서 -80 ° C 냉동고 . </li></ol></li></ol> 3. 면역 형광성 라벨링. <ol><li> Leas에서 0.5 % 탈지 분유, 0.25 % 생선 피부 젤라틴 및 0.5 % Triton X-100을 보충 한 PBS 완충액을 준비합니다t 2 h를 사전에 설명한대로 5 . 참고 : 염색 완충액을 반복적으로 사용하기 위해 항균 보존을 위해 나트륨 아자 이드를 PB 완충액에 첨가 할 수 있습니다. </li><li> 라벨 1.5 ML microcentrifuge 튜브와 튜브 당 PB 버퍼 500 μL를 추가합니다. 조심스럽게 포셉을 사용하여 PBS에서 피부 조각을 차단 용 PB 버퍼가 들어있는 별도의 튜브로 옮깁니다 ( 그림 3a , 오른쪽). 모든 스킨 슬라이스가 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 미세 원심 분리 튜브를 시시 로커에 놓고 상온에서 1 시간 동안 조직 무결성을 방해하지 않는 분당 10 회 이상의 진동을 발생 시키십시오. 참고 : 톱니 모양의 로커에서 속도가 분당 10 번의 진동을 초과하지 않는 것이 중요합니다. 톱니 모양의 로커가 꼬임을 유발할 수 있기 때문입니다. <ol><li> 미세 원심 분리 튜브 당 하나 이상의 슬라이스를 추가하는 것은 가능하지만 항체를 절약하려면 튜브 당 하나의 슬라이스 만 배치하십시오. 항체 사용을 줄이려면 볼륨을 사용하십시오.250 μL. 참고 : 필요할 경우, 예를 들어 96- 웰 플레이트로 마이크로 원심 분리 튜브를 대체하십시오. 그러나, 1.5-mL 미세 원심 분리 튜브에 두꺼운 조직 단면을 배치하면 향상된 액체 섭동으로 인해 조직에 가장 효과적인 항체 침투가 가능합니다. </li></ol></li><li> 각 피부 슬라이스에 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 별도로 레이블 및 PB 버퍼 및 기본 항체의 적절한 금액의 500 μL를 추가합니다. 차단 1 시간 후 항체가 들어있는 새롭게 준비된 튜브에 피부 조각을 옮깁니다. 4에서 조각을 품어 ° C 밤새. 참고 :이 예제에서는 다음과 같은 기본 항체가 사용되었습니다 : 1:50의 농도에서 FITC 쥐 항 - 인간 CD49f와 1 : 100의 농도에서 염소 항 마우스 / 쥐 integrin 알파 8. </li><li> 다음날, 시료 당 PBS 500 μL가 들어있는 2 개의 분리 된 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브를 준비하십시오. 실내 온도에서 1 시간 동안 피부 조각을 2 번 씻으십시오.이자형. </li><li> 적용 가능한 2 차 항체 및 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)의 적절한 농도로 PB 버퍼 500 μL를 포함하는 별도의 1.5 ML microcentrifuge 튜브를 준비합니다. 참고 :이 예제에서 사용되는 보조 항체는 1 : 500의 농도에서 Alexa Fluor 488 당나귀 항 - 래트 IgG 및 Alexa Fluor 555 당나귀 항 염소 IgG입니다. DAPI는 1 : 100의 농도로 사용되었다. </li><li> 조심스럽게 보조 항체와 DAPI가 들어있는 PB 버퍼에 피부 샘플을 옮기고 로터 또는 쉐이커에서 저속으로 1 시간 동안 실온에서 피부 조각을 품어 라. </li><li> 최대 4 일 동안 2 차 항체와 DAPI가 포함 된 PB 완충액에 4 ° C로 슬라이스를 보관하십시오. 나트륨 아자 이드가 PBS에 추가되는 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> 그림 3. Immunofluorescent 라벨 부착 및 장착. ( a ) 부동 조직 단면은 4 ℃에서 최소 2 일 동안 12- 웰 플레이트에 저장할 수 있습니다. immunofluorescent (IF) 표시하기 전에 화살표 1에 표시된 바와 같이 차단을위한 PB 버퍼가 포함 된 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 관심있는 조직 단면을 전송하십시오. IF 라벨 들어, 3 단계에서 정교한 다중 단계 절차를 준수합니다. 각 단계 3의 일부는 화살표 2로 표시된 1 차 항체 용액, 2 차 항체 용액 또는 세척 완충액을 함유하는 새로 제조 된 미세 원심 분리 튜브 내로 조직 단면을 조심스럽게 옮길 것을 요구한다. ( b ) IF 표지 후, 섹션은 해부 현미경의 도움을 사용하여 글리세롤의 물방울에서 풀리고 평평합니다. ( c ) 일단 조직 횡단면이 커버 슬립의 바닥에 완전히 편평하게되면, 일정한 현미경 슬라이드가 단면을 장착하는데 사용된다. <a이 그림의 더 큰 버전을 보려면 href = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot;target = &quot;_ blank&quot;&gt; 여기를 클릭하십시오. 4. 현미경 시각화를위한 설치 <ol><li> 이미징하기 전에 PBS의 500 μL를 포함하는 별도의 microcentrifuge 튜브에 피부 조각을 전송하여 2 차 항체와 DAPI를 씻어냅니다. </li><li> 1000 μL 피펫을 사용하지만, 점도가 높은 글리세롤의 적절한 피펫 팅을 가능하게하려면 피펫 팁의 첫 번째 0.5 cm를 자릅니다. 해부 현미경 ( 그림 3b ) 아래 어두운 배경 위에 22 x 50mm coverslip를 놓으십시오. </li><li> 100 % 글리세롤 한 방울을 커버 슬립에 첨가하십시오 ( 그림 3b ). microcentrifuge 튜브에서 피부 조각을 글리세롤 물방울로 옮깁니다. 해부 현미경과 뾰족한 집게를 사용하여 조심스럽게 구겨져있는 피부 조각을 푸십시오. 참고 : 슬라이스가 gly에 떠있을 때cerol 물방울, 그것은 정상적인 모양으로 돌아갈 수있는 조직의 자연적인 성향을 coaxing하여 untangled 수 있습니다. 슬라이스의 부 자연스러운 직선화를 강요하지 마십시오. 슬라이스가 조직에 손상을 줄 수 있습니다. </li><li> 피부 단면의 전체 길이가 커버 슬립에서 적절하게 배향되고 평평 해지면 티슈를 장착하십시오. 정기적 인 현미경 슬라이드를 사용하십시오. 이 단계는 스킨 슬라이스를 직선화합니다. 참고 : 공기 함몰을 피하십시오 ( 그림 3c ). </li><li> 다음 2 일 이내에 글리세롤 장착 피부 섹션을 이미지하십시오. 참고 : 장기간 보관하면 조직 및 영상 품질에 부정적인 영향을 미칩니다. 이 예제에서 모든 이미지는 20x 대물 렌즈를 사용하여 직립 공 촛점 현미경으로 획득했습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는이 원고의 출판물이 Thermo-Fisher Scientific Inc.에 의해 지원되었음을 공개하고자합니다.

Here, we present the "horizontal whole mount" technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))9 are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies 2,10. 
Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 &#181;m used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines14. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.

현미경 영상 장비의 혁명은 정교하고 고해상도 영상 장비를 제공합니다. 그러나, 완전한 3 차원 (3D) 조직 단면의 현미경 이미지를 획득 할 때, 표본 준비는 상당한 도전을 제시하며 이미지 품질을 정의하는 데있어 제한 요소가 될 수 있습니다. 각각의 개별 단계는 표적 단백질의 조직 형태 및 항원 성을 보존하고, 가공에 의해 유발 된 인공물을 최소화하고, 최종 이미지 품질을 최대화하기 위해 신중한 고려가 필요하다. 예를 들어, 전통적인 피부 분석에서는 표정과 진피를 볼 수있는 이미지가 필요합니다. 모공은 적절하게 배향되어 있으며, 줄기 세포 구획을 피부 항상성 1 , 2에 해부학 적으로 분석 할 수 있습니다. 이것은 피부가 어떻게 매립되고 절단되는지에 대한 철저한 집중이 필요합니다. 중요하게, 모낭은 더 두꺼울 수 있습니다100 μm 이상으로 표준 파라핀이나 동결 절편 두께를 크게 능가하므로 전체 장착 또는 두꺼운 단면 3 , 4 , 5에 비해 분석 표준이 낮아집니다. 종합하여, 현미경 분석을위한 표본 준비의 각 단계는 이미지 분석에 영향을주는 중요한 결정 요소입니다. 여기서 &quot;수평 전체 마운트 (horizontal whole mount)&quot;라고 부르는 두껍고 3D 인 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 항원 성을 유지하고 표준 공 촛점 이미징 장비를 사용하여 피부의 두꺼운 부분을 최대한 활용할 수 있습니다. 조직 수확 및 파라 포름 알데히드 (PFA)를 기반으로 한 저온 보존 (단계 1), 저온 저장 장치로 100 μm 두께의 조직 단면 생성 (단계 1)을 포함한 두꺼운 조직 단면 처리 및 이미징을위한 스킨 사용에 대한 완벽한 안내서입니다. 2), 면역 형광성 라벨링 및 마운팅 (단계 3 및 4). 대표적인 결과는이 프로토콜의 잠재적 인 사용자를위한 &quot;수평 전체 마운트&quot;의 장점을 강조하는 두 가지 별개의 조직 학적 준비 기술 (고전적 절제 및 두꺼운 3D 조직 교차 절삭)의 공 촛점 이미지를 비교합니다.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>homemade</td></tr><tr><td>Gelatin, from cold water fish skin</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>250ML</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BDH Laboratory Supplies</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>VWR chemicals</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way embedding molds</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td>Square S-22</td></tr><tr><td>Non-Fat Powdered Milk</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Human CD49f</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mm Culture dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpels</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr><td>pointed metal forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 Well plates</td><td>Sigma</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul and 1000 ul Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&amp;micro;l XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile)</td><td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&amp;micro;l Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile)</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>Rocking shaker plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides, menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>631-9483</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>Cover Glasses, Menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin

과학적 논증을 뒷받침하는 현미경 이미지를 생성하기 위해 관심 조직을 처리하는 것은 어려울 수 있습니다. 고품질 현미경 이미지의 획득은 현미경의 품질뿐만 아니라 종종 여러 가지 중요한 동작이나 단계를 포함하는 조직 처리 방법에도 달려 있습니다. 또한, 피부 및 다른 조직에서의 중간 엽 세포 유형은 조직 준비 및 영상화를위한 새로운 도전 과제이다. 여기, 우리는 조직 수확에서 현미경으로 완전한 과정을 제시한다. &quot;수평 전체 마운트 (horizontal whole mount)&quot;라고 불리는 우리의 기술은 초보자들이 신속하게 능숙해질 수 있고 저온 유지 장치로 절단 된 60-300 μm 두께의 섹션에서 항원 보존과 검출을 가능하게합니다. 이 두께의 섹션은 3 차원 환경에서 조직 마이크로 아키텍처의 향상된 시각화를 제공합니다. 또한, 프로토콜은 중간 엽 세포를 보존 할 때 이미지 품질을 향상시키는 방식으로표준 저온 유지 장치 또는 파라핀 절편과 비교하여 면역 염색의 효능 및 안정성을 증가시킵니다. 우리는이 프로토콜이 피부 및 다른 조직 및 기관을 시각화하는 모든 실험실에 도움이 될 것으로 믿습니다.

우리 기술의 장점을 강조하기 위해 우리는 두꺼운 3D 조직 교차 절삭 기법 인 &quot;수평 전체 마운트&quot;를 기존의 고정 된 섹션과 비교했습니다. 고전 냉동 섹션은 이전에 설명한대로 잘라 5 . 현미경 이미지에서 표피에 대한 시각적 구조를 제공하기 위해, 우리는 integrin alpha-6 (Itga6)에 대해 면역 염색을하였으며, 이것은 표피 세포를 기저막 6에 고정시키는 성분이다. 우리는 또한 인테그린 알파 - 8 7 (또한 &quot;소름&quot;로 알려진) 경직을 담당하는 arrector의 필리 근육 (APM)를 표시. 고전적인 동결 절편에서 Itga6로 시각화 된 대부분의 모낭은 전체 길이에 따라 절개되지 않았으며, 수평 전체 마운트에 비해 섹션 당 우세하게 불완전한 모낭을 생성했습니다 ( 그림 4a -4d </strong&gt;). 두꺼운 조직 단면은 기존의 10-μm 섹션에 비해 더 많은 Z- 스택 레이어를 획득 할 수 있으므로보다 완벽한 3D 이미지를 구현할 수 있습니다. 이것은 모낭과 위에있는 기저막과 관련된 APM의 무결성을 연구 할 때 더욱 분명 해집니다. 고전적인 절제술에서, APM의 광대 한 부분은 분류되었다 ( 그림 4a - 4d ). 또한 cryosections가 잘 알려진 냉동 동결 해물 인 따뜻한 유리 슬라이드에 부착되었을 때 지방 세포의 파괴와 비교하여 피하 지방실의 조직 무결성이 수평 전체 마운트에서 보존됩니다 ( 그림 4a - b , 피하 지방 영역) 8 . <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> 그림 4. 수평 전체클래식 cryosection에 비해 nt. (a) 고전적 수득 피부는 10 μm의 두께 (B)를 100 ㎛의 두께의 3 차원 조직 단면이 인테그린 알파 6 (Itga6)로 표지하고, 인테그린 알파 8 (Itga8) 시각화 표피 실과 arrector 필리 근육 저온부 로 나타났다. 두꺼운 조직 단면의 이미지는 큰 Z 스택의 최대 투영으로 표시됩니다. 흰색 프레임은 ( c ) 클래식 및 ( d ) 수평 전체 마운트 섹션에 표시되는 확대 된 영역을 나타냅니다. ( e ) 손상되지 않은 모낭과 ( f ) 손상되지 않은 근력 약근 근육은 고전 및 수평 전체 마운트 섹션에서 정량화되었다. 눈금 막대는 100 μm를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표시됩니다. 생물학적 복제 ( n = 3) 당 하나의 섹션을 정량화했습니다. 페어링되지 않은 t- 테스트 * P &lt;0.05, *** P &lt;0.0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

horizontal-whole-mount-novel-processing-imaging-protocol-for-thick

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.1K 조회수.  King's College London.  이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다. 

비디오: Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging organic materials with volumes up to 5 x 5 x 7 mm3 in typical numeric resolutions between 1 x 1 x 1 and 5 x 5 x 5 &#181;m3. Specimens are embedded in methacrylate resin and sectioned on a microtome. After each section an image of the block surface is captured with a digital video camera that sits on the phototube connected to the compound microscope head. The optical axis passes through a green fluorescent protein (GFP) filter cube and is aligned with a position, at which the bock holder arm comes to rest after each section. In this way, a series of inherently aligned digital images, displaying subsequent block surfaces are produced. Loading such an image series in three-dimensional (3D) visualization software facilitates the immediate conversion to digital volume data, which permit virtual sectioning in various orthogonal and oblique planes and the creation of volume and surface rendered computer models. We present three simple, tissue specific protocols for processing various groups of organic specimens, including mouse, chick, quail, frog and zebra fish embryos, human biopsy material, uncoated paper and skin replacement material.

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

We provide simple and robust protocols for processing biopsy material of various species, embryos of biomedical model organisms and samples of other organic tissues in order to permit digital volume data generation with the high-resolution episcopic microscopy method.

고해상도 무시 무시 현미경 (HREM) - 유기 재료의 시각화 및 처리를위한 간단하고 강력한 프로토콜

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

연구

발생학

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

뇌 이식 Microdevices과 주변 조직의 손상 조직 학적 특성

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

신경과학

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, where success depends on the distribution of specific immune cell subpopulations. Over the past decade, multiple sophisticated technologies have been introduced to achieve detailed resolution of the TME using two-dimensional sections from either formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) or fixed-frozen tissues. While these thin sections are easier to procure and analyze, they lack the three-dimensional architecture needed to reliably and comprehensively characterize a tumor. To address this limitation, a tissue mounting and imaging technique was developed to enable the three-dimensional analysis of tumor lesions in their native in vivo state. This protocol outlines the procurement of human tumor tissue, the mounting of samples on custom-printed platforms, and staining procedures for post-fixation samples. The multiplexed immunofluorescence technique, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), was adapted to characterize the three-dimensional TME with up to 15 markers for tumor, immune, and stromal cells using commercially available antibodies. Imaging depths of up to 100 &#181;m were achieved using an inverted white-light laser confocal microscope with a custom-printed imaging adaptor and commercial glass-bottom dishes to ensure optimal tissue orientation. This protocol highlights the potential of the IBEX method to expand multiplexed immunofluorescence studies, providing a more comprehensive understanding of TME composition.

This article describes a protocol for multiplex immunofluorescence optimized to characterize the three-dimensional architecture of peritoneal metastases.

Iterative Bleaching Extends Multiplexity 접근법을 사용한 종양 함유 조직의 3차원 이미징

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

암 연구학

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

생체공학

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

생물학

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

3 차원 조직학 볼륨 및 마우스 유방 땀샘을 연구에의 응용의 재구성

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Fluorescent Reporter 정량화를 통한 전체 장기 병원체 추적

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

저자 스포트라이트: Unraveling Bacterial Responses to Antibiotics and Immune System in Tissues(조직의 항생제 및 면역 체계에 대한 박테리아 반응 규명)

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...