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게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

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10:08 min

August 12th, 2019

August 12th, 2019


0:04

Title

0:22

Preparation of Hybrid Yeast Cells for Transformation

1:55

Transformation of pJR487 into Hybrid Yeast Cells

8:16

Results: Thermotolerance Differences between Species of Saccharomyces

9:44

Conclusion

필기록

우리의 방법은 종 내대신 종 사이의 게놈 전체 규모에 특성 차이의 유전 기지를 해부 할 수있는 첫 번째 중 하나입니다. 이 기술의 주요 장점은 고처리량, 고해상도 및 널리 적용 가능하다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 영하 80도에서 저장에서 JR507 냉동고 재고 변형을 검색하고 YPD 한천 판에 하나의 식민지로 줄입니다.

2일 간 또는 식민지가 나타날 때까지 섭씨 26도에서 배양하십시오. 그런 다음 JR507의 단일 식민지와 250 밀리리터 유리 플라스크에 액체 YPD의 100 밀리리터를 접종하고 200 RPM에서 24 시간 동안 또는 고정 단계에 도달 할 때까지 섭씨 28도에서 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 문화의 od600을 측정합니다.

신선한 액체 YPD로 하룻밤 문화의 일부를 새로운 1 리터 플라스크에 희석하여 0 점 2의 od600과 500 밀리리터의 부피로 새로운 문화를 만듭니다. 이 과정을 세 번 더 반복하여 모든 새로운 문화권에서 동일한 야간 문화를 사용하여 od600의 0포인트 2의 od600을 사용하여 총 4개의 문화를 만듭니다. 200 RPM에서 흔들면서 6 시간 동안 28도에서 모든 문화를 배양하십시오.

그 후 500밀리리터 배양 중 두 가지를 결합하여 1리터 문화를 만듭니다. 나머지 두 500 밀리리터 문화를 결합하여 두 번째 리터 문화를 만듭니다. 첫째, 각 리터 배양을 플라스틱 원뿔 튜브에 각각 20 50 밀리리터 알리쿼트로 분할하여 총 40개의 튜브를 형성합니다.

20개의 튜브를 따로 두십시오. 잔동 세포를 펠릿3 분 동안 1000 회 G에서 나머지 20 개의 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고, 소용돌이에 의해 멸균 물의 25 밀리리터로 각 펠릿을 다시 중단합니다.

3 분 동안 1000 배 G에서 원심 분리기. 상체를 버리고, 1X Tris-EDTA 제로 포인트 1의 5 밀리리터로 각 펠릿을 소용돌이에 의해 1 개의 몰리튬 아세테이트 버퍼로 재차 질한다. 3 분 동안 1000 배 G에서 원심 분리기.

상체를 버리고, 5 밀리리터 1X Tris-EDTA 제로 포인트 1 몰라 리튬 아세테이트 버퍼로 각 펠릿을 다시 다시 재생하여 소용돌이에 의해. 3 분 동안 1000 배 G에서 원심 분리기. 세포가 원심분리되는 동안 폴리에틸렌 글리콜, 리튬 아세테이트 및 Tris-EDTA 버퍼를 포함하는 용액의 적어도 120 밀리리터를 준비하십시오.

이 솔루션을 얼음 위에 저장합니다. 변혁을 위해 혈장 DNA를 준비하기 위하여는, 먼저 5 분 동안 100섭씨에서 연어 정액 DNA의 4밀리리터를 끓입니다. 그 후, 즉시 5 분 동안 얼음에 냉각.

차가운 연어 정자 DNA의 4 밀리리터와 밀리리터 당 538 나노 그램의 농도에서 pJR487의 20 밀리리터를 혼합. 이 혼합물을 사용할 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 각 세포 펠릿 위에 플라즈마 와 정자 DNA 혼합물의 600 마이크로 리터를 추가합니다.

각 펠릿에 PEG 리튬 아세테이트 TE 혼합물 3밀리리터를 추가합니다. 우리는 위아래로 피펫팅한 다음 소용돌이에 의해 중단됩니다. 10 분 동안 실온에서 튜브를 배양.

그런 다음 각 튜브를 수조에서 섭씨 39도에서 26분 동안 가열하여 몇 분마다 각 튜브를 반전시수 있습니다. 3 분 동안 1000 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고, 소용돌이에 의해 YPD의 10 밀리리터에 각 펠릿을 다시 중단합니다.

그 후, 새로운 유리 플라스크에 모든 20 튜브를 결합합니다. 433포인트 4밀리리터의 액체 YPD를 새로운 1리터 유리 플라스크에 넣습니다. 그런 다음 66 점 6 밀리리터의 세포밀리리터를 플라스크로 옮킨다.

변환된 셀의 전체 볼륨을 사용하려면 이 전달 프로세스를 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 각 새로운 500 밀리리터 배양의 od600을 측정합니다. 200 RPM에서 흔들면서 2 시간 동안 섭씨 28도에서 세 문화를 모두 배양하십시오.

이 후 0 점 5 밀리 리터의 300 마이크로 리터 G418 의 각 플라스크에 밀리 리터 당 300 밀리 리터를 추가 밀리 리터 당 300 마이크로 그램. 플라스크를 섭씨 28도, RPM 200도로 흔들리는 인큐베이터에 반환하십시오. 나머지 20개의 원식 튜브를 통해 이 전체 프로세스를 반복합니다.

이 시점에서, G418추가를 가진 세포의 500 밀리리터를 포함하는 각각 6개의 1리터 플라스크가 있어야 합니다. 약 200 RPM에서 약 200 RPM에서 또는 각 플라스크에서 약 2 점 3의 od600에 도달 할 때까지 6 개의 플라스크를 28도에서 모두 배양하십시오. 그런 다음 6개의 플라스크를 모두 결합하여 단일 문화권을 만듭니다.

이 결합 된 문화를 사용하여 YPD와 G418의 500 밀리리터와 함께 두 개의 새로운 1 리터 플라스크를 제로 포인트 2의 od600으로 접종하십시오. 이 새로운 문화를 하룻밤 사이에 28도에서 200 RPM에서 흔들어 서 약 2 점 2의 od600에 도달할 때까지 배양하십시오. 그 후, 두 문화를 하나의 문화로 결합하고 결합된 문화의 od600을 측정한다.

이 문화의 원심분리기 25 밀리리터는 3분 동안 1000배 G로. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 25 밀리리터에 있는 셀의 총 od600 단위수를 계산합니다. 상체를 버리고 충분한 물에 세포를 다시 일시 중지하여 밀리리터 당 1점 85의 od600을 사용하여 세포 현탁액을 만듭니다.

유리 구슬을 사용하여, 5-FOA가있는 12 개의 크고 사각형 완전한 합성 한천 판에 재중단 된 세포의 1 밀리리터를 접시. 각 플레이트를 섭씨 28도에서 1~2일 동안 또는 잔디가 접시에 형성될 때까지 배양합니다. 다음으로, 작은 멸균 스퀴지를 사용하여 접시의 절반에서 세포를 긁어 내고 35 밀리리터의 멸균 물을 포함하는 튜브로 긁습니다.

나머지 6개의 플레이트에 대해 이 과정을 반복하여 두 개의 튜브의 수중 세포를 생성합니다. 셀 서스펜션을 단일 플라스크에 결합하고 물을 빈 플라스크로 사용하여 서스펜션의 od600을 측정합니다. od600이 밀리리터당 44포인트 4에 도달할 때까지 물을 사용하여 세포 농도를 조절합니다.

다음으로, 셀의 냉동고 주식을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 영하 80도에 저장합니다. 이 연구에서, S.Cerevisiae와 S.역설은 돌연변이 발생에 전염되는 멸균 하이브리드를 형성하기 위하여 짝짓기됩니다. 각 돌연변이 클론은 한 유전자의 한 유전자가 중단되는 디플로이드 하이브리드인 헤미자고테입니다.

hemizygotes는 고온에서 경쟁하고, DNA는 각 문화에서 고립됩니다. DNA는 어댑터에 쉬르고, 트랜스포슨과 게놈 사이의 접합은 트랜스포슨 특이적 프라이머와 어댑터 별 프라이머로 증폭된다. 앰플리콘에서 대량 시퀀싱 읽기 수를 계산, 인구에서 클론의 적합성을보고.

이 시퀀싱의 결과로 주어진 유전자에 대한 hemizygote 풍부는 두 종류의 헤미지고테스 사이의 두 온도에서 비교 될 수 있습니다. S.Cerevisiae allele만 야생 유형과 기능성, 그리고 클론은 S.Paradoxus 본선에만 의존하는 클론. 이 대표적인 구현에서, 강한 신호는 8개의 하우스키핑 유전자에서 검출됩니다.

각각의 경우, 하이브리드의 S.Cerevisiae 알레에 있는 트랜스포슨 삽입, 고온에서 의 성장. 이 저-si는 S.Paradoxus에서 S.Cerevisiae를 구별하는 열편협 특성의 후보 결정자를 나타냈습니다. 이제 이 실험을 완료했기 때문에 감기나 소금 내성과 같은 다른 특성을 해부할 수 있습니다.

시퀀싱 (RH-seq)을 통한 상호 반심은 종 간의 특성 차이의 유전적 기초를 매핑하는 강력한 새로운 방법입니다. hemizygotes의 풀은 트랜스포종 돌연변이 발생에 의해 생성되고 그들의 체력은 높은 전반에 걸쳐 시퀀싱을 사용하여 경쟁적인 성장을 통해 추적됩니다. 결과 데이터의 분석은 특성의 근본적인 유전자를 찾아낸다.

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