이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다: NIH R21 EB021870-01A1 NSF 연구 프로젝트 그랜트에 의해: 1517110.

1. 매핑 Fastq 파일
참고: DEEPN 소프트웨어 뿐만 아니라 많은 생물 정보학 프로그램 참조 DNA에에서 그것의 위치에 대 한 각각의 시퀀스를 읽고 매핑된 점에서 DNA 시퀀스 데이터를 사용 합니다. 다양 한 매핑 프로그램이.sam 파일 이후 단계에서 사용을 생산 하기 위해 HISTAT2 프로그램을 사용 하 여 여기 MAPster 인터페이스를 포함 한 사용할 수 있습니다.
<ol><li>게놈의 올바른 버전을 시퀀스 데이터를 매핑하십시오. 마우스 유래의 Y2H 라이브러리 사용 UCSC mm10 게놈; 인간의 유전자를 사용 하 여, UCSC hg38 참조 게놈 유전자를 Saccharomyces cerevisiae 사용, UCSC SacCer3 참조 게놈을 사용 하 여.</li>
	<li>
MAPster를 설치 합니다.
	<ol>
<li>MAPster 소프트웨어 다운로드 및 설치. 다음에 웹 브라우저를 사용 하 여 소프트웨어를 찾을 수 있습니다: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2는 애플 매킨토시와 같은 유닉스 기반 시스템에서 실행 됩니다. 이 때문에, MAPster 프로그램 애플 매킨토시와 리눅스와 같은 호환 되는 시스템에만 실행 됩니다. 참고: 애플 맥에 대 한 시스템 요구 사항은: OSX 10.10 + > 4 기가바이트 RAM, > 500 기가바이트 디스크 공간, 및 참조 게놈을 다운로드 하기 위한 인터넷 액세스. 사용자와 상담 하는 기관 그것은 사람이 그들의 엔터프라이즈 관리자 권한 및 사용 권한을 제한 하는 보안 프로토콜 경우 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
필요한 파일 및 "기본" 탭 (그림 1)을 통해 매개 변수를 입력 합니다. 적절 한 "Pairwise" 버튼을 파일을 입력으로 쌍 또는 기본 파일 형식으로 FASTQ와 홀 중 하나를 선택 합니다.
	<ol>
<li>DEEPN 분석에 대 한 단일 읽기 형식에서 실행 하는 "Off"로 "Pairwise" 옵션을 설정 합니다.</li>
		<li>드래그-앤-드롭 적절 한 창에 의해 단순히 MAPster 파일 로드.</li>
		<li>Y2H 먹이 라이브러리 삽입의 소스에 해당 하는 DNA/게놈 소스 참조를 선택 합니다. 여러 모델 생물에서 인덱싱된 게놈 "게놈" 상자에 나열 되 고 다운로드 될 수 있다 자동으로 존스 홉킨스 대학 센터에서 전산 생물학에 대 한. 참조 게놈은 나중에 사용 하기 위해 로컬로 저장 됩니다.</li>
		<li>HISAT2 지원 멀티 스레딩 이후 "스레드" 상자에서 매핑 프로그램에 헌신 하 게 될 컴퓨터 프로세스의 수를 나타냅니다. MAPster는 컴퓨터를 검색 하 고 기본적으로 사용할 수 있는 프로세서의 최대 수는 것이 좋습니다.</li>
		<li>출력 파일 이름을 지정 합니다. 이 파일 이름은 공백이 나 특수 문자 없이 짧은 아직 설명 이름 좋습니다 그래서 DEEPN 과정 전반에 걸쳐 사용 됩니다. "오픈 출력 디렉터리" 단추를 사용 하 여 매핑된 파일을 출력 폴더를 지정 합니다.</li>
		<li>일단 적절 한 파일 및 매개 변수를 선택 "대기열에 추가" 버튼을 사용 하 여 작업 큐를 매핑 작업을 추가 합니다. 주 창에서 파일 이름을 수 삭제 하 고 파일에 해당 하는 새 예제로 교체 하 고 해당 출력 파일 이름이 제공 된 후 큐에 추가할 수 있습니다.</li>
		<li>모든 작업은 작업 큐에 입력 되 면 "실행 큐" 버튼을 클릭 합니다. 참고: 매핑 작업 큐에 배치 되었습니다, 일단 "작업 매개 변수" 창에 "작업 명령" 창에 표시 될 모든 인수 사용 하 여 명령줄 문을 표시할 매개 변수 설정을 그 일을 선택 하면 됩니다. 출력 옵션 정렬에 실패 계속 읽기 여부 감독 등 각 읽기에 대해 허용 하는 기본 정렬 수 지정. 기본 출력 파일 MAPster에서 샘 형식 (예: '.sam' 파일)입니다. 그것은 모든 fastq 파일에서 시퀀스 읽기 (매핑된) 했다를 포함 하 여 그 샘플에 대 한 지정 되지 않았습니다 포함 됩니다 (매핑하지) 지정 된 geome를 성공적으로 매핑된.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bioinformatic 처리를 사용 하 여 DEEPN 소프트웨어
참고: DEEPN 소프트웨어는 현재 컴파일 사용 마우스 cDNA 시퀀스, 인간 cDNA 시퀀스, 또는 S. cerevisiae genomic DNA 순서를 포함 하는 먹이 라이브러리와. DEEPN 표준.sam 파일 포맷을 수락 하 고 매핑되지 않은 매핑된 읽기 각 매핑된 및 매핑되지 않은 읽기 또는 별도 파일을 포함 하는 샘 (.sam) 파일을 받아들일 수 있다.
<ol><li>DEEPN 소프트웨어 다운로드 및 설치. 다음에 웹 브라우저를 사용 하 여 소프트웨어를 찾을 수 있습니다: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. 컴퓨팅 플랫폼 및 다운로드 버전 일치를 선택 합니다. 를 설치 하려면 다운로드 한 설치 패키지를 엽니다. 참고: 버전 DEEPN의 PC, 맥, 그리고 리눅스 sysrems 사용할 수 있습니다. Mac과 PC 시스템 있어야 > 500 Gb 하드 디스크 공간 및 > 4gb의 RAM.</li>
	<li>
DEEPN 소프트웨어를 엽니다. 주 창 (그림 2)에서 위쪽 선택 상자에서 해당 먹이 라이브러리 정보를 선택 합니다. 처리 된 파일 폴더/디렉터리를 "작업 폴더" 버튼을 클릭 하 여 이동 갈 수 있는 폴더를 선택 합니다. 하나는 필요한 경우 새로운 폴더/디렉터리를 만들 수 있습니다. "작업 폴더"를 선택 DEEPN unmapped_sam_files, mapped_sam_files, 및 sam_files는 3 개의 하위 폴더를 만듭니다.
	<ol>
<li>경우.sam 파일 포함 된 매핑된 및 매핑되지 않은 읽기 등을 사용 하 여 MAPster 프로그램의 기본 설정으로, 'sam_files' 폴더에 넣어. 그렇지 않으면 장소.sam 파일 unmapped_sam_files와 mapped_sam_files에 따라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"유전자 수 + 접합" 확인 버튼을 클릭 하 여 처리를 시작 합니다. 참고: 처리는 각 유전자에 해당 하는 얼마나 많은 읽기를 매핑 위치를 사용 하는 유전자 수 모듈 함께 시작 됩니다. 접합 확인 다음 추출 접점 시퀀스 (시퀀스 직접 융합 Gal4 활성화 도메인에서 다운스트림) 읽기에서 폭발 알고리즘을 사용 하 여 그들을 식별 하 고. 이것은 그림 3에 표시 하는 폴더의 전체 집합을 만듭니다. 처리 시간 크기와 시퀀스 데이터 파일의 수 및 사용 하는 컴퓨터의 처리 속도에 따라 달라 집니다. 전형적인 시간 범위 12-30 h ~ 250 백만의 실험 데이터 집합에서 읽습니다. 유전자 수 절차 및 Junction_Make 절차는 "유전자 개수" 단추 또는 "접합" 확인 버튼을 클릭 하 여 개별적으로 시작할 수 있습니다.</li>
	<li>
다운로드 및 설치 Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). 현재 유닉스 맥 시스템 에서만 작동 DEEPN 데이터 집합을 위한 통계 분석 패키지입니다.
	<ol>
<li>Stat_Maker을 "설치 확인" (그림 4) 버튼을 클릭 합니다. 처음으로 실행 하는 경우 Stat_Maker 자동으로 설치 합니다 R, JAGS, 및 Bioconductor는 인터넷에서 이러한 리소스를 당겨. 일단 R, JAGS, 및 Bioconductor를 감지 Stat_Maker 활성화 하 고 추가 사용자 입력을 허용.</li>
		<li>DEEPN 처리 작업 폴더 탐색 "폴더 선택" 버튼을 클릭 합니다. Stat_Maker 자동 발견 하 고 창에서 통계 분석을 위해 파일을 나열 합니다.</li>
		<li>적절 한 파일에서에서 끌어서 위의 파일 목록 창 각 벡터 및 미끼 데이터 집합에 대 한 및 각 성장 조건에 대 한 아래 파일 창으로: 선택 되지 않은 (그의 + 미디어) (그의-미디어)을 선택. 중요 한 것은, Stat_Maker의 두 샘플 선택 및 빈에 대 한 중복 데이터 집합 벡터 혼자, 선택 되지 않은 인구의 두 샘플 필요 합니다. 이 실험에서 가변성의 견적을 제공합니다.</li>
		<li>"실행" 버튼을 클릭 합니다. 컴퓨터의 속도 따라 계산 5-15 분 사이 걸릴 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Stat_Maker" 결과 주요 작업 폴더 내에서 새로운 하위 폴더에 배치 되는 Stat_Maker 출력 결과 검토 합니다. 참고: 결과 CSV (쉼표로 구분 된 값) 파일을 열 수 있는 일반적인 스프레드시트 프로그램에서 발견 된다. Stat_Maker 차동 미끼와 함께 관심을 선택 빈 pTEF GBD (그림 5)에 농축 될 가능성이 높은 유전자 안타를 평가할 것 이다. 또한 표로 어디 유전자 삽입 발견 업스트림, 다운스트림, 또는 열려있는 독서 프레임 및 올바른 변환 독서 내 유전자도 발견 여부 내 각 데이터 집합에 대 한 읽기 비율이입니다. 종종 DEEPN 해당 단백질의 적절 한 독서 프레임에서 또는 해당 오픈-독서 프레임의 하류는 cDNA의 부분에는 주어진된 cDNA의 일부와 미끼의 강력한 Y2H 상호 작용을 사로잡을 것입니다. Stat_Maker에서 결합 된 출력 스캔 탐지 및 제거가 없는 안타의 합리화.</li>
	<li>
각 잠재적인 후보에 대 한 데이터를 검토 하려면 DEEPN 소프트웨어를 열고, 해당 먹이 라이브러리 정보 및 다음 "작업 폴더"를 사용 하 여 올바른 작업 폴더를 선택 합니다.
	<ol>
<li>"폭발 쿼리" 버튼을 클릭 합니다. 이 새로운 창 (그림 6)를 로드합니다. 위쪽 텍스트 상자에서 유전자 이름 또는 관심사의 후보 유전자 선택 은행 NM 번호를 입력 합니다. 이러한 유전자 이름 StatMaker 출력 파일에 나열 된 이름에 해당 합니다. 유형 입력 하거나 반환,이 관심사의 유전자의 검색을 시작 합니다.</li>
		<li>어떤 데이터 집합 "데이터 집합 선택" 메뉴를 사용 하 여 분석을 위해 사용 됩니다를 선택 합니다. 일반적으로, 이러한 벡터만 포함 하 고 선택적 비 조건에서 성장 하는 샘플 및 선택 조건 하에서 성장 하는 미끼 샘플 미끼. 그러나 처음, 데이터를 로드 하는 데 몇 분 걸릴 것입니다, 그리고, 다른 유전자와 같은 데이터 집합의 후속 쿼리 빠르게 갈 것입니다. Blast_Query는 관심과 각 융해 점은 어떻게 풍부한의 순서에 따라서 퓨전 포인트 표시 됩니다. 이 모두 "결과" 탭을 사용 하 여 테이블 형식 또는 "플롯" 탭을 사용 하 여 그래픽 형식에 표시 될 수 있습니다. 이러한 결과 오른쪽 상단에 있는 ".csv 저장" 버튼을 클릭 하 여.csv 파일로 내보낼 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 후보자 DEEPN 식별 확인
참고: DEEPN 및 Stat_Maker의 목적은 긍정적인 Y2H 상호 작용을 주는 후보 유전자를 식별 하는. 같은 Y2H 상호 작용을 확인 수 수 관심의 미끼 플라스 미드를 사용 하 여 전통적인 이진 Y2H 형식을 사용 하 여 할 빈 Gal4 활성화 도메인 '먹이' 플라스 미드와 결합 뿐 아니라 먹이 플라스 미드의 유전자 또는 cDNA 조각 들고와. 그것은 효 모 인구 Y2H 선택 대상에서 분리 된 DNA의 혼합물에서 관심사의 실제 플라스 미드 분리 가능. 그러나, 하나의 수 계산 유전자 또는 cDNA 조각 Y2H 상호 작용을 생성 하는 재구성, 5'과 3' 그 파편의 끝에 대 한 프라이 머 디자인과 효 모 인구에서 고립 된 DNA에서 그 단편을 증폭. 후보 먹이 조각의 5'과 3' 끝을 찾는 방법에 설명 합니다.
<ol><li>DEEPN 소프트웨어 열고 매개 변수 "선택 매개 변수" 및 "작업 폴더 선택"에 해당 하는 프로젝트의 작업 폴더를 선택 합니다. "폭발 쿼리" 버튼을 클릭 하 여 Blast_Query 모듈을 실행 합니다.</li>
	<li>
관심이 나 그것의 은행 "NM"의 유전자의 이름을 입력 합니다 위쪽 텍스트 상자에 숫자. 풀 다운 메뉴에서 해당 하는 선택 된 효 모 인구 미끼에 대 한 관심의 접합 위치 '결과' 탭의 테이블을 검색 하는 데이터 집합을 선택 합니다. 기본적으로 Blast_Query 그들의 풍부한 데이터베이스 내 연결의 총 수의 ppm으로 정량 데이터 집합에 따라 다른 위치를 주문할 것 이다.
	<ol>
<li>가장 풍부한 위치는 "ORF에" 와 "프레임에". 위치에 대 한 값은 상위 텍스트 상자에 NCBI 참고 순서 ('NM' 번호) 유전자의 염기 위치에 해당 합니다. 이 시퀀스는 은행 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)에서 검색 하거나 Blast_Query 창에서 아래쪽 텍스트 상자에서 복사 될 수 있습니다. 참고: 예를 들어 그림 6, 중간 패널에서에서 찾을 수 있습니다. 센터에는 '결과' 가장 풍부한 교차점으로 표시: '위치': 867; '#Junctions': 20033.821; '쿼리 시작', 1; CD: ORF;에 그리고 '프레임': 프레임에. 은행 NCBI 참고 순서 NM_019648의 뉴클레오티드 867 먹이 파편의 시작 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>쿼리를 시작 하는 것이 1, 뇌관 포함 위치 번호에 해당 하는 뉴클레오티드의 5' 끝을 디자인 하 고 그 위치 (그림 7)에서 다운스트림 25 뉴클레오티드를 연장. 쿼리 시작은 이상의 1, 관심사의 먹이 순서 Gal4 활성화 도메인 사이의 여분의 뉴클레오티드는 고 그 뇌관 시작 한다 더 하류 쿼리 시작 값에 따라 것을 나타냅니다.</li>
	<li>DEEPN 창에서 "데이터 분석" 아래 "깊이 읽기" 버튼을 클릭 합니다. 일단 읽기 깊이 창이 열리면, 상단 텍스트 상자에 NCBI 참조 시퀀스 (NM) 번호 또는 유전자 이름을 입력 합니다. 풀 다운 메뉴를 사용 하 여 관심의 풍부한 유전자를 포함 하는 관련 데이터 집합을 선택 합니다. 왼쪽에 테이블을 사용 하 고 그래픽 얼마나 많은 읽기의 관심 (그림 7B) 유전자에 해당 하는 데이터에서 발견 된 확인 하려면 오른쪽에 표시.</li>
	<li>3' 끝 뇌관 읽기 깊이 계산 유전자 조각의 시퀀스 캡처 것입니다 디자인. ORF 넘어 읽기의 풍부한 경우 codon 중지, 정지 코 돈과 정지 codon의 상류 그냥 지역 포함 되도록 뇌관 디자인. 유전자에 대 한 시퀀스 정지 codon 과거를 확장 하지 않습니다, 경우 결과 표를 사용 하는 가장 먼 3' 영역을 검색 하는 멀리 3'로이 위치를 사용 하 여 뇌관을 배치 하는 위치. 참고: 읽기 깊이 프로그램 관심의 지정 된 유전자 또는 cDNA를 일치 하는 시퀀스를 찾을 수 간격으로 검색 합니다. 이 샘플에서 해당 유전자에 대 한 가장 풍부한 먹이 조각의 5'과 3' 끝이 예측할 수 있습니다. 시퀀스의 길이 따라 읽기 깊이에서 동요는 정상, 그림 7에서 볼 수 있습니다. 이면 읽기 깊이 명확 하 게 정지 codon 과거 먹이 조각 정지 codon를 지 나 확장 하 고 따라서 3' 뇌관 단순히 정지 codon 주변 지역 대응 될 수 있습니다 나타냅니다.</li>
	<li>
유전자 당 50 µ L PCR 반응을 수행 합니다. 각 반응 포함 각 정방향 및 역방향 뇌관 먹이 도서관 플라스 미드를 일치의 25 pmol (재료의 표 참조). 반응 또한 높은-충실도 2 x PCR 마스터 믹스의 25 µ L, 5 µ g의 DNA 샘플, 그리고 50 µ L까지 물을 포함합니다.
	<ol>
<li>72 ° C, 어 닐 링 30 55 ° C의 온도에서 3 분의 확장 시간 25 사이클에 대 한 반응을 증폭 s, 98 ° C 10에서 변성 시키기 사이클링 98 ° C에 30 s 변성에 의해 선행 s. 고 따라 72 ° c.에서 5 분 부 화와</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+Next-Generation+Sequencing+Reads.">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13 (2016).</li></ol>

저자 공개할 게 없다

여기에 설명 된 소프트웨어 제품군 완전히 처리 하 고 높은 처리량 DEEPN 실험에서 DNA 시퀀싱 데이터를 분석 한 수 있습니다. 사용 하는 첫 번째 프로그램은 MAPster 표준 fastq 파일에서 DNA 순서 읽기 하 고 다운스트림 처리 DEEPN 소프트웨어를 포함 한 정보 프로그램의 전체 호스트에 대 한 참조 DNA에 그들의 위치를 지도. MAPster 인터페이스와 결합 입력된 파일, 여러 작업을 대기열에 능력의 유틸리티 cove...

단백질 상호 작용을 발견 하는 한 가지 방법은 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과, 어떤 악용 설계 관심사의 단백질의 상호 작용 파트너1조각에 묶을 때에 자라는 효 모 세포 이다. 여러 Y2H 상호 작용의 탐지는 지금 대규모 병렬 높은 처리량 시퀀싱의 도움으로 할 수 있습니다. 여러 가지 형식 되었습니다 설명2,3,,45 포함 한 우리가 개발 인구 일괄 생성 하 플라스 미드를 포함 하는 효 모에 대 한 선택 하는 조건 하에서 재배 되는 긍정적인 Y2H 상호 작용6. 워크플로 우리 개발, 되 나 DEEPN (동적 농축 단백질 네트워크의 평가 위한), 하나의 단백질 (또는 도메인) 대와 상호 작용 하는 단백질을 식별 하기 위해 같은 먹이 라이브러리에서 차동 interactomes 식별. 다른 단백질 또는 conformationally 별개의 돌연변이 도메인입니다. 이 워크플로의 주요 단계 중 하나는 적절 한 처리 및 DNA 시퀀싱 데이터의 분석 이다. 유사한 RNA-seq 실험의 Y2H 상호 작용 방식에서 선택 전후에 둘 다 각 유전자에 대 한 읽기 수 계산 하 여 몇 가지 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나, Y2H 상호 작용을 만들 수 있는 특정된 단백질의 하위 도메인에 대 한 정보를 포함 하 여이 데이터 집합에서 훨씬 더 자세한 정보를 추출할 수 있습니다. 또한, 반면 DEEPN 방식은 귀중 한 많은 샘플 복제 분석 수 복잡 하 고 비싼입니다. 이 문제는 복제의 수는 제한6DEEPN 데이터 집합을 위해 특별히 개발 된 통계 모델 사용 하 여 완화 됩니다. 있도록 처리 및 DNA 시퀀싱 데이터 집합의 분석, 완전 한, 강력한, 안정적이 고 접근 없이 생물 정보학 전문 수 사관에 대 한, 우리는 분석의 모든 단계를 커버 하는 소프트웨어 프로그램의 한 벌을 개발 했다.
데스크톱 컴퓨터에서 실행 되는 독립 실행형 소프트웨어 프로그램의이 제품군 MAPster, DEEPN, 및 Stat_Maker 포함 되어 있습니다. MAPster 다운스트림 응용 프로그램에 사용 하기 위해 표준.sam 파일을 만드는 각 fastq 파일 대기7HISAT2 프로그램 사용 하 여 게놈에 매핑할 수 있는 그래픽 사용자 인터페이스입니다. DEEPN 여러 모듈 있다. 그것은 할당 하 고 해당 특정 유전자 유사한 ' 유전자 개수 ' 모듈을 사용 하는 RNA-seq 형식 정량화 하는 읽기를 계산. 그것은 또한 Gal4 transcriptional 도메인 및 먹이 시퀀스 사이의 교차점에 해당 하는 시퀀스를 추출 하 고 대조 비교 테이블 및 그래프 (를 사용 하 여 모듈 'Junction_Make')에 의해 그들의 검사를 허용 하도록 이러한 연결의 위치 모듈 'Blast_Query' 쉬운 검사와 정량, 접합 Gal4 접점 시퀀스의 비교를 허용 한다. Stat_Maker는 통계적으로 확률이 Y2H 안타에 우선 순위를 지정 하는 방법으로 유전자 농축 데이터 당 읽기 평가 합니다. 여기, 우리는 이러한 소프트웨어 프로그램을 사용 하 고 완전히 DEEPN Y2H에서 데이터 실험 DNA 시퀀스를 분석 하는 방법을 설명 합니다. 버전 DEEPN의 PC, 맥, 그리고 리눅스 시스템에서 실행할 수 있습니다. MAPster 매핑 프로그램 같은 다른 프로그램 및 DEEPN 통계 모듈 Stat_Maker 서브루틴 유닉스에서 실행 하 고 Mac 및 linux 시스템에만 사용할 수 있습니다에 의존.

<table><tbody><tr><td>Mapster</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td></tr><tr><td>DEEPN software</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Statmaker</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Minimum computer system</td><td>Apple</td><td></td><td>Mac Intel Core i5 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>OS 10.10 or higher</td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td></td><td>Intel i5-7400 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>Windows 7 or higher</td></tr></tbody></table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

우리는 동시에 높은 처리량 짧은 읽기 DNA 시퀀싱을 활용 한 화면 내에서 임시 및 정적 단백질 상호 작용의 수십을 밝히기 위해 효 모 2 잡종 분석 결과 적응 했습니다. 결과 시퀀스 데이터 집합 수 뿐만 아니라 인구에 긍정적인 효 모 2 잡종 상호 작용을 위해 선택 하는 동안 풍성 하 게 하는 어떤 유전자를 추적 하지만 또한 상호 작용에 대 한 충분 한 단백질의 관련 하위 도메인에 대 한 자세한 정보를 제공. 여기, 우리는 비-전문가 모든 생물 정보학 및 통계 단계를 처리 하 고 일괄 처리 효 모 2 잡종 분석 결과에서 DNA 시퀀스 fastq 파일을 분석을 수행할 수 있는 독립 실행형 소프트웨어 프로그램의 전체 제품군을 설명 합니다. 이러한 소프트웨어에 의해 보호 처리 단계를 포함: 해당 각 후보 단백질 효 모 2 잡종 먹이 라이브러리;에서 인코딩 하 1) 매핑 및 계산 순서 읽기 2) 통계 분석 프로그램을 평가 하는 농축 프로 파일; 그리고 3) 변환 프레임 및 관심사의 상호 작용 단백질 인코딩합니다 각 농축된 플라스 미드의 코딩 영역 내에서 위치를 검사 하는 도구.

Fastq 데이터 매핑: 첫 번째 단계 실질적으로 모든 NGS 응용 프로그램 DEEPN 초기 출력은 짧은 시퀀스 읽기 게놈에 정렬 하 여 매핑할 수 합니다 파일을 포함 하 여, transcriptomic, 또는 다른 DNA8참조. 최근, HISAT2 맞춤 프로그램 최신의 색인 생성 알고리즘을 사용 하 여 매핑 속도7,9를 극적으로 증가 하는 ...

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

효 모 인구 잠재적으로 긍정적인 효 모 2 잡종 상호 작용에 대 한 선택의 깊은 시퀀싱 풍부한 파트너 단백질 상호 작용에 대 한 정보를 생성 합니다. 여기, 우리가 특정 생물 정보학 도구와 같은 화면에서 시퀀스 데이터 분석 사용자 지정 된 업데이트 소프트웨어의 동작을 설명 합니다.

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

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7.1K 조회수.  University of Iowa. 효 모 인구 잠재적으로 긍정적인 효 모 2 잡종 상호 작용에 대 한 선택의 깊은 시퀀싱 풍부한 파트너 단백질 상호 작용에 대 한 정보를 생성 합니다. 여기, 우리가 특정 생물 정보학 도구와 같은 화면에서 시퀀스 데이터 분석 사용자 지정 된 업데이트 소프트웨어의 동작을 설명 합니다.

비디오: Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

연구

생화학

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

유전학

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

생물학

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

면역학 및 감염병학

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Yeast Two-Hybrid 기법을 이용한 생체 분자 상호 작용 연구 

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the role(s) and function(s) of a specific protein-protein interaction is to compare the phenotype of the wild-type (with the relevant protein-protein interaction) and those of mutants that lack the relevant interaction. Therefore, if such mutants can be isolated, they will help to elucidate the related biological processes. The yeast two-hybrid (Y2H) procedure is a powerful approach not only to detect protein-protein interactions but also to isolate interaction-null/impaired mutants. In this article, a protocol is presented to isolate interaction-null/impaired mutants using Y2H technology. First, a mutation library is constructed by combining the polymerase chain reaction and efficient seamless cloning technology, which efficiently excludes the empty vector from the library. Second, interaction-null/impaired mutants are screened by the Y2H assay. Because of a trick in the Y2H vector, undesired mutants, such as those with frameshift and nonsense mutations, are efficiently eliminated from the screening process. This strategy is simple and can, therefore, be applied to any combination of proteins whose interaction can be detected by the two-hybrid system.

저자 스포트라이트: 효모에서 상호 작용-null 돌연변이의 향상된 분리

The interactions of biomolecules, such as protein-protein interactions, are the molecular basis of biological functions. If interaction-null/impaired mutants that specifically lack the relevant interaction can be isolated, they will greatly help to understand the function(s) of this interaction. This article presents an efficient way to isolate interaction-null/impaired mutants.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

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단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

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게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리