증가 증거는 생리학의 식민지 부분에 에스트로겐 신호의 영향을 제안, 면역 집중 화학결에 에스트로겐 수용체를 식별하기위한 유망한 기술이며 대장염으로 진화. 우리는 면역 형광을 사용하여 결장의 에스트로겐 수용체의 면역 히스토케토화학 시각화를위한 완전하고 검증 된 프로토콜을 제시합니다. 로츠 대학의 현미경 이미징 연구소의 실위아 Michlewska 박사와 함께, 우리는 절차를 시연 할 것입니다.
결장은 페트리 접시에 놓습니다. 결장들을 1~2센티미터 의 조각으로 자른다. 적절하게 표시된 조직학적 카세트에 각 조각을 스폰지에 놓습니다.
4%의 파라포름알데히드에 결장 파편이 들어 있는 카세트를 놓습니다. 섭씨 4도에서 최소 24시간 동안 배양하세요. 50%70%90%95%와 100%에탄올, 자일렌 100%에탄올, 자일렌만으로 1시간 동안 티슈 프로세서를 준비하고 프로그래밍할 뿐만 아니라 액체 파라핀에서 적어도 3시간 동안 배양할 수 있다.
결장 조각을 조직상자로 옮는다. 미리 프로그래밍된 티슈 프로세서에 상자를 배치하고 프로세서를 실행합니다. 조직 프로세서에서 의배복 후 조직 상자에서 결장 제거 하 고 금속 금형에 결장 조각을 배치, 결장의 두 끝이 똑바로 위치에 있도록.
금형의 3분의 1을 액체 파라핀으로 채웁니다. 금형을 섭씨 영하 5도에서 몇 초 동안 그대로 두은 다음 금형을 섭씨 70도의 온난화 영역으로 옮습니다. 그런 다음 금형을 조직 상자의 하단 부분에 놓고 전체 결장 조각을 액체 파라핀으로 덮습니다.
콜론 파편과 파라핀을 함유한 금속 금형을 냉각 부위에 몇 분 간 배치합니다. 그런 다음 결장 과 파라핀 블록에서 금속 금형을 제거합니다. 섭씨 4도에서 적어도 24시간 동안 결장과 파라핀 블록을 배양합니다.
인큐베이션 후 블록에서 과도한 파라핀을 제거합니다. 결장과 파라핀 블록을 완전히 자동화된 로터리 마이크로토메에 삽입합니다. 결장 조각을 5 마이크로미터 섹션으로 자른다.
1개의 결장 구간을 수조로 옮기고, 예열된 섭씨 40도. 라벨이 부착된 유리 슬라이드를 사용하여 수조에서 결장 섹션을 제거하고 실온에서 유리 슬라이드를 24시간 동안 배양합니다. 먼저, 5분 동안 자일렌에 유리 슬라이드를 배양하여 파라핀을 제거합니다.
이 단계를 세 번 반복합니다. 그런 다음 유리 슬라이드를 자일렌과 100% 에탄올의 일대일 혼합물에 5분간 놓습니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
결장 섹션을 재수화하기 위해 감소 에탄올 농도의 시리즈를 사용합니다. 에탄올에 슬라이드를 5분간 담그십시오. 다음 농도로 진행하기 전에 각 농도에서 세 번 반복하십시오.
유리 슬라이드를 흐르는 물 아래5분간 헹구십시오. 항원 검색 버퍼를 섭씨 95~98도로 재가열합니다. 그런 다음 끓는 항원 검색 용액에서 유리 슬라이드를 10 분 동안 가열합니다.
시약의 낭비를 방지하기 위해 소수성 펜을 사용하여 결장 섹션 주위에 원을 그립니다. 그런 다음, 과산화수소와 물의 3%용액에서 슬라이드를 10분 동안 배양합니다. 슬라이드를 세척 용액으로 5분간 세척합니다.
그런 다음 실온에서 1 시간 동안 차단 용액의 슬라이드를 배양합니다. 차단 용액을 제거하고 E-R 알파, E-R 베타 또는 G-P-E-R 희석에 대한 1차 항체의 20~50마이크로리터를 추가한다. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1 차 항체를 배양하십시오.
항체 용액을 제거합니다. 매번 5분간 세척용액으로 슬라이드를 세 번 씻습니다. 다음으로 희석된 이차 항체를 추가합니다.
어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 염료로 컨쥬게이징된 이차 항체로 슬라이드를 배양합니다. 슬라이드에서 이차 항체 용액을 제거합니다. 매번 5분간 세척용액으로 슬라이드를 세 번 씻습니다.
멤브레인 시각화를 위해 희석 된 플루오로크롬을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 용액을 제거하고 매번 5 분 동안 세척 용액으로 슬라이드를 세 번 씻습니다. 세포 핵 시각화를 위한 플루오로크롬인 글리세롤 계 액체 DAPI를 결장 섹션에 직접 추가합니다.
커버 슬라이드로 조심스럽게 덮습니다. 섭씨 4도에서 적어도 24 시간 동안 결장 섹션을 배양하십시오. 20배 또는 63배 의 목표와 오일 침지를 특징으로 하는 공초점 현미경으로 결장 섹션을 분석합니다.
이 연구에서 사용된 항체의 특이성은 MCF-7 세포를 사용하여 검증되었다. 에스트로겐 수용체 항체는 핵 에스트로겐 수용체 E-R 알파 및 E-R 베타뿐만 아니라 막 경계 에스트로겐 수용체 G-P-E-R의 검출을 가능하게 하였다. 또한 MCF-7 세포가 불소크롬과 DAPI를 가진 글리세롤 계액체로 컨쥬게이트된 이차 항체로만 염색된 음의 대조군도 수행하였다.
E-R 알파의 강력한 세포질 신호는 대조마우스와 TNBS 유도 크론병을 가진 마우스로부터 얻은 결장 섹션에서 발견되었다. 그러나, 대조마우스로부터 얻은 결장만이 잔세포 세포질에서 국소화된 E-R 알파를 가졌다. 공초점 현미경 검사는 또한 대조군과 TNBS 처리마우스의 결장 단면도에 있는 E-R 베타의 세포질 국소화를 밝혔습니다.
유사하게, G-P-E-R의 세포질 국소화는 대조군 마우스와 TNBS 처리된 마우스에게서 얻은 결장 섹션에서 문서화되었다. 금형에서 콜론의 올바른 위치는 올바른 단면을 생성하는 데 필수적입니다. 플루오로크롬은 자체 여기 및 방출 스펙트럼에 의해 선택되어야 합니다.
이 방법은 또한 대장염의 발달에 관여할 수 있는 그밖 단백질에 적용될 수 있습니다. 면역형광에 의한 면역력 화학 검출은 단백질 단백질 방향 상태에서 다른 단백질을 얼룩지게 확장될 수 있다.
