축 하 전송 신경 건강 및 생존에 대 한 중요 한. 당사의 프로토콜은 축산 운송을 모니터링하고 분석하는 우아한 방법을 설명합니다. 및 다양한 신경 질환 모델에 적응할 수 있다.
미세 유체 챔버의 사용은 축축생물학을 연구하는 데 중요한 정밀한 공간 측두제어를 가능하게 합니다. 축 하 수송 이상은 ALS와 같은 몇몇 신경 퇴행성 질병과 연루됩니다. 미세 유체 플랫폼은 축산 운송 결함을 복구하기 위해 기본 메커니즘뿐만 아니라 테스트 치료법을 연구 할 수 있습니다.
미세 유체 챔버 플랫폼은 축산 성장 및 다양한 신경 아류형의 변성을 포함하여 축산 연구의 다양한 측면에 맞게 쉽게 적응 할 수 있습니다. 이 방법은 복잡하고 일반적으로 실습을 가르칩니다. 시각적 데모는 축산 운송을 공부하는 데 관심이있는 과학자에게이 절차의 접근성을 증가시킬 것입니다.
기본 금형에서 PDMS를 캐스팅하는 것으로 시작합니다. 가압 공기를 사용하여 웨이퍼 플랫폼에서 먼지를 제거하여 웨이퍼가 진행되기 전에 부드럽고 선명하게 보이도록 하십시오. 다음으로, 액체 질소로 용기를 채우고 23 게이지 바늘로 10 밀리리터 주사기를 준비합니다.
화학 연기 후드에 플레이트가 함유된 웨이퍼를 밀봉 용기에 넣고 주사기를 각 웨이퍼당 2밀리리터의 액체 질소로 채웁니다. 클로로트리메틸틸렐틸레인 병을 엽니다. 주사기로 고무 캡을 관통하고 병에 질소를 주입합니다.
바늘을 꺼내지 않고 병을 거꾸로 뒤집어 접시가 들어있는 각 웨이퍼에 대해 클로로트리메틸틸레인 2 밀리리터를 빼놓습니다. 클로로트리메틸틸란을 용기에 펴지만 플레이트가 들어 있는 웨이퍼에는 직접 적으로 발라놓지는 않습니다. 컨테이너를 닫습니다.
그리고 웨이퍼 당 5 분 동안 배양하십시오. 다음 무게 47.05 50 밀리 리터 튜브에 PDMS 베이스의 그램, 총 50 그램에 대 한 경화 에이전트에 16 대 1 염기의 비율로 PDMS 경화 제를 추가. 저속 회전기에서 10분 동안 PDMS를 혼합한 다음 플레이트를 포함하는 각 웨이퍼에 붓습니다.
진공 건조기 안에 플레이트를 두 시간 동안 놓습니다. PDMS 내에 갇힌 공기를 제거하고 명확한 균일 한 금형을 형성합니다. 그 후 오븐에서 접시를 3시간 또는 70°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
미세 유체 챔버 또는 MFC를 만들 수 있습니다. 메스로 접시에서 PDMS 금형을 자르고 제거하여 금형이 깨지기 쉽기 때문에 금형을 강제로 강요하지 않도록 합니다. 실험 설정에 따라 텍스트 원고의 지침을 따라 챔버를 펀치하고 잘라냅니다.
척수 절제 문화의 경우, 대형 MFC의 탈경 측에 7mm 우물 두 개를 펀치하여 채널 가장자리와 겹칠 수 있도록 하십시오. 근위 쪽에서는 채널 중앙에 7mm 를 잘 펀치하여 최소한의 겹침으로 충분한 공간을 남겨두게 됩니다. 근동 채널의 두 모서리에 두 개의 1밀리미터 구멍을 추가로 펀치.
그리고 PDMS를 단일 챔버로 잘라. 그런 다음 MFC를 위쪽으로 돌리고 20 게이지 바늘을 사용하여 펀치 7 mm의 작은 동굴 세 개를 개척합니다. 해리된 운동 신경 배양을 위해, 작은 MFC의 두 채널의 가장자리에 있는 4개의 6mm 웰을 펀치하고 PDMS를 단일 챔버로 잘라냅니다.
MFC를 소독하려면 벤치에 50센티미터 길이의 끈적끈적한 테이프 밴드를 펴보시면 됩니다. 그런 다음 테이프에 있는 챔버의 양면을 누르고 다시 당깁니다. 깨끗한 챔버를 새로운 플레이트에 놓고 분석 등급으로 인큐베이션하여 70%에탄올을 궤도 셰이커에 10분 동안 배양합니다.
에탄올을 폐기하고 조직 배양 후드 또는 70섭씨에서 오븐에서 챔버를 건조시다. 그런 다음 조직 배양 등급 유리 바닥 도랑의 중심에 챔버를 배치하고 접시 바닥에 PDMS를 바인딩가장자리에 약간의 힘을 적용합니다. 섭씨 70도에서 10분간 요리를 배양합니다.
그런 다음 준수를 강화하기 위해 챔버를 누릅니다. UV 아래에서 10분 동안 접시를 배양한 다음 MFC코딩을 진행합니다. 밀리리터 PLO당 1.5 나노그램을 두 구획에 넣습니다.
PLO가 채널을 통해 실행되고 있는지 확인합니다. 채널 입구에서 코팅 매체를 직접 피펫팅하여. 가벼운 현미경으로 MFC를 검사하여 거품을 확인합니다.
기포가 마이크로 홈을 차단하는 경우 MFC를 진공 건조기에 2분 동안 배치합니다. MFC 채널에서 과도한 공기를 제거합니다. 그런 다음 PLO와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션하십시오.
PLO를 라미닌으로 교체하고 MFC를 추가로 배양합니다. 도금 전에, 배양 매체로 라미닌을 씻으라. ICR E12.5 임신 한 마우스를 해부하고 양수 낭에서 배아를 분리합니다.
HBSS 실리콘 접시에 배아를 넣습니다. 머리와 꼬리를 제거하고 그의 배에 뒤집어. 배아에서 피상적인 피부를 부드럽게 벗겨 척수를 노출시십시오.
부드러운 핀셋을 사용하여 척수를 몸에서 꼬리로 분리합니다. 수막을 제거한 다음 등경을 제거하고 척수를 1mm 두께의 횡단 섹션으로 자른다. MFC의 근동 구획에서 모든 배지를 폐기합니다.
총 4개의 마이크로리터로 파이펫으로 척수 한 개를 집어들세요. 그리고 동굴에 가능한 한 가까이 주입. 측면 콘센트를 통해 근위로부터 여분의 액체를 잘 뽑습니다.
이전 단계를 두 번 더 반복하고 각별이 근위 채널에 포함되는지 확인합니다. SCEX 배지 150마이크로리터를 근동에 천천히 추가합니다. 도금 후 하루.
근위실의 SCEX 배지를 교체하고 풍부한 SCEX 배지를 탈구에 추가합니다. 실산 우물과 근해 우물 사이의 우물 당 적어도 15 마이크로 리터의 체적 그라데이션을 유지합니다. 4~6일 후에축축은 낙후 구획으로 넘어가서 축축운송 영상에 대비해야 한다.
미토콘드리아와 산성 구획에 라벨을 부착하려면 100나노몰러 미토트래커 딥 레드 FM과 100 나노몰러 리소트래커 레드로 신선한 SCEX 배지를 준비한다. 그리고 미세 유체 챔버에 추가합니다. 섭씨 37도에서 30~60분 동안 인큐베이션을 사용해 보배하세요.
그런 다음 따뜻한 SCEX 매체로 세 번 씻습니다. 축 산 교통의 라이브 이미징진행. 3초 간격으로 100시간 경과 이미지 시리즈를 획득합니다.
영화당 총 5분. 미세 유체 챔버에서 7 일 후. 마우스 배아 HB9 GFP 척수 이월.
우리는 미토 트래커 딥 레드와 리소 트래커 레드 염료로 얼룩져 있습니다. 미토콘드리아와 산성 구획에 라벨을 부착하십시오. 축삭 홈내의 축삭을 이미지화하고 Kymograph 분석은 일반적인 이동 분포를 결정하기 위해 사용되었다.
이것은 산성 도시 구획에서만 역행 방향으로 편향을 드러냈지만 미토콘드리아 수송에서는 그렇지 않았습니다. 입자 밀도는 또한 정량화되어 HB9 GFP 척수 의 산성 구획에 비해 더 많은 수의 미토콘드리아 입자를 드러내며 축삭을 내다녔다. 다음으로, 반자동 소프트웨어를 사용하여 단일 입자 전송 분석을 수행한 다음 사내 코드가 뒤따랐습니다.
이 분석은 산성 성분과 미토콘드리아가 유사한 입자 속도를 가지고 있음을 밝혔다. 그러나 산성 구획만이 역행 운동에 대한 편견을 표시합니다. 배아 척수를 고립시키는 것은 처음에는 어려울 수 있습니다.
올바른 배아 나이와 적절한 해부 도구를 사용해야하는이 절차를 여러 번 연습하십시오. 미세 유체 챔버의 사용은 우리가 축 축 생물학을 공부하는 방식을 변경합니다. 그것은 우리가 한 번 세포 본문에서만 발생 하는 가설 있어 지역화 된 축 하 과정을 시각화 할 수 있습니다.
