우리의 프로토콜은 통제된 세포외 환경 및 온화한 질병 상태에서 성상세포 세포기관 또는 단백질의 운동성 그리고 현지화를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 단백질과 세포기관 국소화의 단일 스냅샷을 제공하는 MHA 고정 제제와 는 달리, 우리의 라이브 이미징 기술은 개별 살아있는 성상 세포에서 입자 역학을 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 24~48시간 후 의 이미징을 위한 적절한 밀도에서 형질 전환 종자 성상세포가 성상세포에 이른다.
적절한 실험 농도로 감소된 혈청 배지에서 리포페션 시약을 희석시. 감소된 혈청 매체의 250 마이크로리터에 고순도 DNA5마이크로그램을 희석하고 5마이크로리터의 리포페션 강화 제분시 시약을 튜브에 첨가한다. 리포페션 시약을 DNA 리포션 증강제 믹스의 동일한 부피와 혼합하고 실온에서 15분 동안 용액을 배양합니다.
인큐베이션의 끝에서, 성상 세포 배양에서 상체를 제거하고 세포에 드롭 방향으로 형질 혼합물의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 6시간 후, 성상세포 배양 배지의 적절한 부피로 트랜스포팅 복합체를 교체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 24~72시간 더 되돌려 한다. 이미징 30분 전에, 성상세포 배양 배지의 200 마이크로리터에 적합한 리소말 라벨링 프로브를 희석시키고 1개의 마이크로몰러의 작동 농도로 희석하고 37°C에서 30분 동안 프로브로 성상세포에 라벨을 붙입니다.
그런 다음 따뜻한 성상세포 배양 배지로 세포를 한 번 씻고 세척을 이미징 매체로 대체하십시오. 프로브 라벨링 직후, 성상세포 배양 용기를 현미경 단계의 적절한 어댑터에 넣고 EBI 형광광을 사용하여 형광 단백질 또는 프로브를 발현하는 세포를 찾습니다. 디지털 카메라를 사용하여 형광 시료 조명을 조정하여 선택한 셀을 시각화하고 초점을 조정하고 단일 셀로 확대합니다.
그런 다음 줌 및 서정 초점 기능을 사용하여 300초에서 500초 사이의 시간 간격을 위해 2초마다 한 프레임의 주파수에서 단일 Z 스택 타임랩스 시리즈를 획득합니다. AVI 또는 TIFF 스택 파일로 시간 경과 이미지를 저장하고 내보냅니다. 시간 경과 이미지를 분석하려면 ImageJ 또는 Fiji에서 시간 경과 이미지 시퀀스를 열고 분할 채널 도구를 사용하여 채널을 분할합니다.
8비트 녹색 채널 이미지에서 세그먼트 된 선 도구를 사용하여 모든 영화에 대해 동일한 원하는 방향 규칙을 사용하여 입자의 궤적을 따라 선을 추적하여 극성이 연구되는 모든 세포 안팎에서 일관되도록합니다. 라인 도구를 두 번 클릭하여 선 너비를 조정하여 트랙의 두께에 맞게 조정하고 10의 라인 너비를 사용하여 Kymo ToolBox 플러그인의 그리기 키모 매크로를 실행합니다. 시간과 공간에서 이미지를 보정하라는 메시지가 나타납니다.
보정되면 kymograph가 생성되고 TIFF 파일로 저장할 수 있습니다. 파티클 궤적을 할당하려면 분할 된 선 도구를 사용하여 수집 기간 내내 kymograph의 각 입자를 수동으로 추적하고 ROI 관리자를 사용하여 각 입자 궤적을 관심 영역으로 기록합니다. 추가 분석을 위해 각 시간 경과 비디오당 관심 영역을 모두 저장하고 Kymo ToolBox 플러그인의 키모 분석 매크로를 실행합니다.
드롭다운 메뉴에서 관심 셀의 핵에서 파티클 모션의 바깥쪽 방향을 정의하라는 요청창이 열립니다. 제한 속도는 관심있는 각화물에 대한 소프트웨어의 감도에 따라 정의되어야하며 라인 폭은 각 입자 궤적의 두께에 맞게 조정되어야합니다. 로그 모든 데이터 및 로그 추정 좌표는 다양한 화물 운송 매개 변수를 계산하기 위한 것이어야 합니다.
확인을 클릭합니다. 개별 트랙에 대해 계산된 데이터는 kymograph당 풀을 만들고 각 이미지에 특정한 텍스트 파일에 저장됩니다. 시토신 아라비노사이드 처리와 흔들림 기반 정화 전략을 결합하면 정화 단계만 포함하는 전통적인 프로토콜에 비해 성상세포 배양의 순도가 강화됩니다.
Lipofection 기반 의 트랜스페션은 독성을 유발하거나 성상 세포 생존가능성에 영향을 미치지 않으면서 살아있는 세포 이미징에 최적수준에서 단백질의 일시적인 발현을 허용합니다. 마찬가지로, 형광 프로브의 사용은 세포역학 및 성상 세포의 추적을 위한 산성 내피 소기관기관의 신속하고 효율적인 라벨링을 허용합니다. 이미징의 시간 경과 데이터는 시간과 공간에서 화물 움직임을 추적하는 kymographs를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
이러한 kymographs에서, 표시된 화물의 전방 이동은 부정적인 경사면이있는 궤적으로 표현되며 역행 운동은 긍정적 인 경사면이있는 궤적으로 표현됩니다. 고정 된 소포는 수직 궤적으로 나타납니다. 이 분석에서, 성상세포 영역을 통해 특정 화물의 플럭스의 정량화는 영화가 획득한 성상세포 영역에서 정상 기저선 운동성을 대표할 가능성이 있는 화물 중 모달 입자의 비율에 차이가 있음을 밝혔다.
kymograph에서 얻은 각 입자에 대한 풀 타임 스케일을 따라 X, Y 위치의 변화의 정확한 매핑은 또한 화물 속도 및 실행 길이와 같은 다른 모션 매개 변수를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 고품질 성상세포 문화와 효율적인 화물 라벨링을 필요로 하므로, 경질 시약 잠복 기 및 획득 일정은 관심있는 각 플라스미드 또는 화물에 맞게 조정되어야 합니다. 이 프로토콜은 세포 손상, 독성, 병원성 돌연변이, 시냅스 활동 또는 세포 내 또는 세포 외 환경의 변화에 대한 응답으로 성상세포에서 의한 운송 이벤트를 특성화하도록 수정될 수 있다.
