우리는 AI 실험실의 모든 구성원에게 도움이되는 의견과 제안을 해주신 것에 대해 감사드립니다. 셔틀 -GFP 벡터를 제공 한 Mark Hipp 교수 (Max Planck 생화학 연구소)에 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF # 124 / 14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794), Israel National Psychobiology Institute NIPI # b133-14 / 15).

1. 세포주 준비 <ol><li> 액체 질소 용기에 저장되어있는 마우스 신경 모세포종 척수 세포 (NSC-34 cells) 약 1,000,000 개를 해동합니다. 세포가 완전히 해동 될 때까지 37 ° C의 물 배양기를 사용하십시오. </li><li> 신선한, 따뜻한 매체 (10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % L - 글루타민, 1 % 펜 strep 항생제를 포함하는 DMEM 매체)를 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 500xg에서 해동 된 세포 (SL16R)를 원심 분리하여 세포 펠렛을 형성한다. 배지를 버리고 세포 재현 탁의 새로운 배지 1 mL를 첨가한다. </li><li> 15 ML 플라스크에 resuspended 세포를 놓고 여분의 5 ML 매체를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 와 멸균 배양기에서 하룻밤 사이에 세포를 품어. </li><li> 병행하여, 60mm 배양 접시에 8 개의 코팅되지 않은 커버 슬립 (커버 유리 : 12mm, 0.13-0.17mm 두께)을 놓고 70 % 에탄올을 사용하여 멸균하고 건조 될 때까지 30 분간 자외선에 노출시킵니다. 각 접시에 매체를 넣고 처분하여 잔류 에탄올을 씻어냅니다.</li><li> 그들이 약 90 % 합류 (플라스크 당 약 6 백만 세포)에 도달 후 접착 세포가 해리 수 있도록 트립신 버퍼 (2.5g의 트립신과 행크의 균형 소금 솔루션 1L에 EDTA 0.2g)를 추가합니다. 주의 : NSC-34 세포는 민감하며, 배지를 사용하기 전에 트립신 완충 배양 15 초 및 트립신이없는 배양 1 분을 추가로 요구한다. </li><li> 접시 당 약 35,000, 매체 3 ML과 coverslips 이미 포함 된 60mm 문화 요리에 세포를 판다. coverslips에 세포 부착을 허용하기 위해 24 시간 동안 인큐베이터에 그들을 남겨주세요. </li></ol> 2. 세포 형질 감염 참고 : 약 24 시간 후, NSC-34 세포는 40 % 컨 플루 언스 (약 800,000 세포)에 도달하고 형질 감염을위한 준비가 완료됩니다. <ol><li> 살균 microcentrifuge 욕조에 순수 DMEM 매체 (각 60mm 문화 접시에 대한 DMEM 매체 300 μL)를 준비es. </li><li> 각 DMEM 포함 microcentrifuge 튜브에 transfection에 필요한 각 플라스미드 2 μg을 추가합니다. 참고 : 셔틀 -GFP 플라스미드는 모든 세포 형질 감염에서 필수적입니다. </li><li> 필요한 플라스미드가 들어있는 모든 미세 원심 분리 튜브에 트랜스 팩션 시약을 넣으십시오. 여기에 2 μg의 DNA마다 상업용 형질 전환 시약 4 μL를 넣으십시오. </li><li> DMEM, 플라스미드 및 형질 감염 시약이 들어있는 미세 원심 분리 튜브를 와동시키고 실내 온도에서 25 분 동안 배양하십시오. </li><li> 배양 접시에 각 미세 원심 분리 관을 추가하고 부드럽게 균질 한 용액을 형성하도록 접시를 저어주십시오. 48 시간 동안 인큐베이터에서 접시를 다시 놓습니다. 참고 : shuttle-GFP는 모든 세포에서 발현되어야하므로 shuttle-GFP transfection 효율을 부분적으로 검사하고 밤새 형질 감염 후 형광 현미경을 사용하여 사전 테스트 할 수 있습니다. 면역 형광법 분석기를 사용하여 비 형광으로 발현 된 단백질의 전체 검사를 수행 할 수 있습니다.입니다. </li></ol> 3. 현미경 검사 <ol><li> 분리 된 죽은 세포를 제거하기 위해 coverslip 홀더에 transfected NSC-34 세포를 포함 coverslips를 첨부하고 인산염 완충 식염수 (PBS)로 부드럽게 씻으십시오. </li><li> 거꾸로 된 현미경으로 녹색 형광 필터를 사용하여 적합한 세포 패치를 식별. 참고 : 적합한 세포 패치는 많은 수의 세포 (한 분야에서 20-30 개의 세포)와 핵이 세포에서 명확하게 정의되어있는 현미경 시야로 정의됩니다. 세포 패치 내의 세포 핵은 먼저 눈으로 확인되고 이미징 소프트웨어에 의해 수동으로 표시됩니다. </li><li> 현미경으로 coverslips에 버퍼를 물방울에 coverslips에 PBS에 10 NG / ML LMB를 포함 exportin - 1 억제제 Leptomycin B (LMB) 버퍼의 200 μL를 추가합니다. 참고 :이 시점은 간격 0으로 설정됩니다. </li><li> 약 400-500 초 동안 3 초 간격으로 표시된 핵의 형광 강도를 정량화하십시오. </li><li&gt; 각 실험에서 각 transfection 그룹에 대해 3 ~ 5 커버 슬립을 테스트하십시오. </li></ol> 4. 분석 참고 : 다른 세포가 형광성 셔틀 GFP의 다른 수준을 표현하기 때문에 각 세포의 핵 형광 강도를 자체 초기 형광 강도로 정상화하는 것이 중요합니다. <ol><li> 각 핵의 3 초 형광 간격을 핵의 초기 6 개 간격의 평균으로 나누어 표시 핵의 형광 강도를 표준화합니다. </li><li> 각 핵의 정상화 후, 각 세포 패치에 대한 시간의 함수로서 핵 형광의 변화를 나타내는 형광 강도 곡선을 생성하십시오. 이렇게하려면 각 세포 - 패치 (각 패치에서 대략 20-30 개의 세포로 이루어짐)의 모든 세포의 평균을 계산하십시오. 참고 : 핵 형광 강도 곡선은 마이클리스 - 멘텐 포화 곡선과 유사하며, 증가 된 ti 내에서 더 잘 관찰됩니다나 마침표. 이것은 핵 수송으로 인한 시간에 따른 셔틀 -GFP의 세포질 양의 감소 때문이다. 이 감소는 셔틀 -GFP가 핵으로 운반 될 확률을 통계적으로 낮추어 핵 형광에서 포화 상태에 이른다. 곡선의 선형 초기 속도로부터 유도 된 기울기는 핵으로의 Vmax 진입 속도를 산출한다. </li><li> 그래프 소프트웨어를 사용하여 3-5 개의 독립적 인 실험에서 파생 된 각 셀 패치의 V 최대 기울기를 분석하여 각 실험 그룹을 나타내는 하나의 기울기를 생성합니다. 일원 분산 분석 (ANOVA) 통계 분석을 사용하여 정량화를 수행하십시오. </li></ol> 5. 단백질 발현 검증 <ol><li> 얼음에 각 실험 그룹에서 잔여 세포 (위의 실험에 사용되지 않음)를 포함 60mm 문화 요리를 놓으십시오. </li><li> 배지를 버리고 PBS로 세포를 두 번 씻어서 희석하고 나머지 배지를 씻으십시오. </li><li> 200-400으로 세포를 치료하십시오.PBS, 0.5 % 트리톤 및 프로테아제 억제제 칵테일 타블렛 (PI)을 함유하는 용해 완충액 1 μL. 셀 스크레이퍼를 사용하여 긁으십시오. </li><li> microcentrifuge 튜브에 용해 버퍼에 세포를 수집하고 얼음 아래 1 분 4,000 rpm으로 homogenizer로 균질. </li><li> 10 분 2,500 XG에서 균질 세포를 원심 분리기. 상등액을 수집하고, Bradford 분석법을 사용하여 단백질 농도를 정량화하고 -20 ℃에서 사용할 때까지 보관하십시오. </li><li> 총 단백질 30 ~ 70 μg (단백질에 따라 다름)을 모으고 SDS-PAGE 젤에 넣고 면역 블 롯 분석을 사용하여 단백질 발현을 시험합니다. </li></ol>

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이 프로토콜은 nucleocytoplasmic 교통의 미세 변화를 평가하는 매우 민감하고 정량적 인 새로운 분석을 보여줍니다. 이 시스템을 사용하면 단백질 분포에서 극적인 변화를 가져 오는 큰 결함뿐만 아니라 실시간으로 핵 세포질 수송과 그 기능 장애를 관찰하고 측정하는 것이 가능합니다. 이 분석법은 감도 우위를 가질뿐만 아니라 준비가 거의 필요없고 저렴하며 매우 쉽고 낮은 결합 분석법입니다. </p...

NPC (nuclear pore complex)는 세포핵 내외로의 큰 분자의 반입 및 반출을 제어합니다. 제 1 규칙없이 핵에 들어갈 수있는 작은 분자와 달리, 더 큰 분자의 수송은 NPC에 의해 강력하게 제어된다. 단백질과 RNA와 같은 이러한 거대 분자는 임 핀틴 (importin)과 엑스 핀틴 (exportins)을 포함한 수송 요소와 연관되어 핵에서 수입되고 수출된다. 수입을 위해서, 단백질은 일반적으로 핵 위치 확인 신호 (NLS)라고 불리는 작은 펩타이드 모티프를 가져야하며, 이것은 임포트린 2 에 의해 결합됩니다. 이러한 아미노산의 배열은 tag로 작용하고 composition 3 , 4 에서 다양합니다. 단백질은 exportin과의 연관 때문에 핵에서 세포질로 내보낼 수 있습니다.일반적으로 핵 수출 신호 (nuclear export signal, NES) 2 라고 불리는 신호 서열에 결합한다. 수입업자와 수출업자 모두 작은 Ras 관련 핵 단백질 GTPase (Ran) 2 의 규제로 인해화물을 운송 할 수 있습니다. Ran은 그것이 GTP 또는 GDP에 결합되어 있는지 여부에 따라 다른 형태의 상태로 존재하는 것으로 나타났습니다. GTP에 바인딩되면 Ran은 importins 또는 exportins에 바인딩 할 수 있습니다. RanGTP에 바인딩되면 수입업자는화물을 방출하고 수출업자는 RanGTP를 묶어 수출화물과 복합체를 형성해야합니다. Ran의 지배적 인 뉴클레오타이드 결합 상태는 핵 (RanGTP) 또는 세포질 (RanGDP)에서의 그의 위치에 의존한다. 최근 많은 연구에서 핵 세포질 경로의 손상과 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 전 측두엽 성 치매 (FTD) 사이의 연관성이 밝혀졌습니다 5 , 6 </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런 (MN) 13 모두에 영향을 미치고 평균적으로 2 ~ 5 년 내에 마비와 궁극적으로 사망에 이르는 진행성 및 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다. ALS의 대부분의 경우는 산발적 (SALS)으로 분류되며 명백한 유전 적 연계가 없지만 10 %는 우성 방식 (가족 성 ALS; FALS)으로 유전됩니다. 최근, ALS와 FTD의 유전 적 원인으로 염색체 9 ​​오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자의 헥사 뉴클레오타이드 반복 확장 (HREs)이 14 , 15 로 확인되었다. 이러한 돌연변이는 FALS 사례의 30-40 %를 차지하고 있으며, 여러 연구가 쟁점을 가지고있다핵 세포질 수송에 영향을줌으로써 독성을 유발한다는 것. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . 이 연구들은 핵 세포질 수송에 대한 HRE의 최종 결과와 발현을 대부분 보여 주었지만 실시간으로 핵 세포질 파괴를 입증하지 못했습니다. 그 결과 심한 핵 세포질 운반체 결핍이 11 , 17 , 18 에서만 평가되었다. 이 프로토콜은 새롭고실시간으로 nucleocytoplasmic transport dysfunction을 평가하고 정량화하는 민감 분석. NLS-NES-GFP 단백질 (shuttle-GFP)의 유입 속도는 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 정량화 할 수 있습니다. 이것은 이전에 설명한 바와 같이 exportin 억제제를 사용하여 이루어 지므로 셔틀 -GFP 만 핵에 들어갈 수 있습니다. 형광 현미경 및 실시간으로 형광 변화를 정량화 할 수있는 소프트웨어를 사용하여 핵에 위치한 셔틀 -GFP의 형광 강도의 점진적 변화를 정량화 할 수 있습니다. 결과적으로, 임의의 주어진 시간에서 핵 셔틀 -GFP의 양을 나타내는 형광 - 시간 축의 미카엘리스 - 멘틴 (Michaelis-Menten) 형 포화 곡선이 만들어 질 수있다. 곡선의 초기 선형 속도를 사용하여 형광 포화 전에 핵에 들어가는 속도를 나타내는 기울기를 생성 할 수 있습니다. 분석을 확인하기 위해 번역이전에 핵 세포질 수송을 방해한다고보고 된 C9orf72 디 펩티드 반복체, 폴리 (GR) 및 폴리 (PR)은 5 , 7 , 8 , 10 , 12로 사용 되었다. 이 분석법을 사용하여, 대조군에 비해 핵 수입률이 50 % 감소했다. 이 시스템을 사용하여 nucleocytoplasmic 수송의 미세한 변화를 검사 할 수 있습니다. 또한, nucleocytoplasmic 전송 결함을 구출하는 다양한 요인의 능력을 확인할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531&quot;&gt;R0531&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

Nucleocytoplasmic 수송은 세포핵에서 큰 분자의 수입과 수출을 의미합니다. 최근 여러 연구에서 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 핵 세포질 경로의 손상이 연관되어 있음이 밝혀졌습니다. ALS는 평균 2 ~ 5 년 내에 마비가되고 궁극적으로 사망에 이르는 운동 신경 세포에 영향을주는 신경 퇴행성 질환입니다. ALS의 대부분의 경우는 산발적이며 명백한 유전 적 연계가 없지만 10 %는 지배적 인 방식으로 유전됩니다. 최근, 염색체 9 ​​오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자의 헥사 뉴클레오타이드 반복 확장 (HREs)이 ALS 및 전두 측두엽 치매 (FTD)의 유전 적 원인으로 확인되었다. 중요한 것은, 다른 그룹은 최근 이러한 돌연변이가 nucleocytoplasmic 수송에 영향을 제안했습니다. 이 연구들은 핵 세포질 수송에 대한 HRE에 의해 야기되는 최종 결과와 증상을 대부분 보여 주었지만, 핵 수송 장애를 증명하지는 못했다.실시간. 결과적으로 심각한 핵 세포질 운반체 결핍이 결정될 수 있는데, 이는 대부분 높은 과발현 또는 외인성 단백질 삽입 때문이다. 이 프로토콜은 실시간으로 nucleocytoplasmic 수송 장애를 평가하고 정량화하는 새롭고 매우 민감한 분석을 설명합니다. NLS-NES-GFP 단백질 (shuttle-GFP)의 유입 속도는 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 정량화 할 수 있습니다. 이것은 exportin 억제제를 사용하여 수행되므로 셔틀 GFP 만 핵에 들어갈 수 있습니다. 분석을 검증하기 위해, 이전에 핵 세포질 수송을 방해하는 것으로 밝혀진 C9orf72 HRE 번역 된 디 펩티드 반복체, 폴리 (GR) 및 폴리 (PR)이 사용되었다. 설명 된 분석법을 사용하여, 대조군과 비교하여 핵 수입율이 50 % 감소했다. 이 시스템을 사용하여 nucleocytoplasmic transport의 미세한 변화를 조사 할 수 있으며 nucleustoplasmic tr (심지어 부분적으로)을 구출하는 여러 요소의 능력진단 결함이 결정될 수 있습니다.

여기에 제시된 절차를 사용하여, 모터 뉴런과 같은 NSC-34 세포를 NLS-NES-GFP (셔틀 -GFP) 단백질로 형질 감염시켰다. 이 단백질은 NLS와 NES 신호 서열 ( 그림 1 )을 가지고 있으며, 핵과 세포질 사이를 왕래 할 수 있습니다. 일반 GFP는 확산에 의해서만 현지화 신호 태그가 없기 때문에 핵에 들어 오거나 나가기 때문에 핵과 세포질 사이에 고르게 분포됩니다 ( 그?...

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

이 프로토콜은 NLS-NES-GFP 단백질의 핵 임포트에서 실시간 변화를 정량화함으로써 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 핵 세포질 수송 속도를 민감하게 측정하는 방법을 설명합니다.

모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

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Neuroscience

8.6K 조회수.  Ben-Gurion University of the Negev.  이 프로토콜은 NLS-NES-GFP 단백질의 핵 임포트에서 실시간 변화를 정량화함으로써 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 핵 세포질 수송 속도를 민감하게 측정하는 방법을 설명합니다. 

비디오: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

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Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

연구

발생학

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 &quot;화물 매핑&quot;분석

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

신경과학

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

원자력 교통 단일 분자 이미징

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

생물학

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

AMPA 모니터링을 위한 하이 콘텐츠 분석 결과 수용 체 매매

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing recognition of cell-specific differences in nuclear pore complex structure, prompting a need to adapt nuclear transport methods for use in neurons. Permeabilized cell assays, in which the plasma membrane is selectively perforated by digitonin, are widely used to study passive and active nuclear transport in immortalized cell lines but have not been applied to neuronal cultures. In our initial attempts, we observed the rapid loss of nuclear membrane integrity in primary mouse cortical neurons exposed to even low concentrations of digitonin. We hypothesized that neuronal nuclear membranes may be uniquely vulnerable to the loss of cytoplasmic support. After testing multiple approaches to improve nuclear stability, we observed optimal nuclear integrity following hypotonic lysis in the presence of a concentrated bovine serum albumin cushion. Neuronal nuclei prepared by this approach reliably import recombinant fluorescent cargo in an energy-dependent manner, facilitating analysis of nuclear import by high content microscopy with automated analysis. We anticipate that this method will be broadly applicable to studies of passive and active nuclear transport in primary neurons.

We have developed a reliable method of selective plasma membrane permeabilization of primary mouse cortical neurons for high content automated analysis of neuronal nucleocytoplasmic transport.

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

축삭 수송의 생체 내 이미징을위한 툴킷 확장

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.