Name: pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells at JoVE.com

대표적인 데이터는 국립암연구소(K22CA218549~S.T.S.S)를 통해 지원되었다. 본 원에 보고된 포괄적인 분석 방법 개발에 도움을 주는 것 외에도, 오하이오 주립대학 종합암 센터 비교 병리학 및 마우스 Phenotyping 공유 리소스(디렉터 – 크리스타 라 펄, DVM, 박사)에게 조직학 및 면역 조직화학 서비스 및 알고리즘 개발 및 분석을 위한 병리학 이미징 코어에 감사드립니다.

동물 사용은 OSU 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)-승인 프로토콜 2007A0120-R4 (PI: 지나 사이즈모어 박사)에 따라 대학 실험실 동물 자원 (ULAR) 규정을 따랐다.
1. 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입
<ol><li>세포 및 주사 주사기 의 준비<ol>
<li>사용되는 마우스 및 세포 농도의 수에 따라 적절한 수의 세포를 플레이트. 참고: 전이의 발달에 주입된 세포의 수와 시간은 사용된 세포주에 따라 달라지며 최적화되어야 합니다. 본 데모에서, 1 x 106 MDA-MB-231 세포는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스로 정맥주사되고, 거시성 폐 병변은 24일 이내에 사후 주입 후 관찰된다. MVT1 뮤린 유방 종양 세포 17의 경우, 3 x 106 세포는 14일22,23에 의해 관찰된 수많은 폐 전이를 가진 면역 유능한 FVB/N 마우스로 주입된다.</li>
		<li>1x PBS로 세포판을 흡입하고 헹구세요. 트립시니징 셀을 최소한의 부피로, 적절한 양의 매체를 추가하고, 혈종계 또는 다른 바람직한 방법을 사용하여 세포를 계산합니다. Trypan 파란색(0.4%) 또는 기타 라이브/데드 셀 염료를 사용하여 실행 가능한 세포 수를 결정할 수 있습니다.</li>
		<li>펠릿 셀은 180 x g 에서 5 분 동안 회전합니다.</li>
		<li>마우스당 100 μL의 부피가 주입되는 멸균 1x PBS에서 적절한 수의 세포를 재일시 중단합니다. 생존력을 유지하기 위해 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.</li>
		<li>주입 하기 전에, 완전히 응고를 피하기 위해 200 μL 또는 1 mL 파이펫으로 세포를 다시 중단. 28G 인슐린 주사기에 100 μL을 그립니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>주사기를 수직으로 유지하고 주사기를 두드리고 플런저를 천천히 조정하여 기포를 제거하십시오. 정맥에 기포를 주입하면 치명적일 수 있는 공기/가스 색전증이 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>측면 꼬리 정맥 주입 참고: 실험적인 유방암 전이 assays를 위해, 주사는 6주 된 암컷 마우스를 > 수행됩니다.<ol>
<li>꼬리에 의해 마우스를 처리하고 적절한 크기의 슬롯 튜브 / 구속 장치로 동물을 밀어 넣습니다 (사용되는 구속 장치에 대한 재료 표 참조).</li>
		<li>구속 장치의 플러그 부분을 삽입하고 측면 꼬리 정맥이 쉽게 볼 수 있도록 측면에 마우스를 배치합니다. 마우스는 생식기, 등류 정맥 및 2 개의 측면 카우달 정맥에 맞춰 복부 동맥을 가지고 있습니다.</li>
		<li>무균 닦아 마우스 꼬리의 표면을 청소합니다. 검지 손가락과 엄지 손가락 사이의 꼬리를 지배적이지 않은 손으로 잡고 약간의 긴장을 가합니다.</li>
		<li>꼬리의 말단 부분에서 시작하여, 벨끝으로 정맥에 평행하게 바늘을 삽입한다.</li>
		<li>허용되는 경우 조심스럽게 바늘 을 다시 캡 하고 20-30 ° 각도로 구부립니다. 한 손으로 접근하거나 바늘 재래핑 장치를 적극 권장합니다. 참고: 정맥이 붕괴될 수 있으므로 흡인할 필요는 없습니다. 그러나, 혈액의 작은 플래시처음 배치 될 때 볼 수 있습니다. 바늘은 적절한 배치와 정맥으로 원활하게 진행됩니다.</li>
		<li>전체 볼륨을 정맥에 천천히 분배합니다. 플런저를 밀어붙일 때 저항해서는 안 됩니다.</li>
		<li>저항이 느껴지면 주사기 바늘을 즉시 제거하십시오. 필요한 경우 꼬리의 근위 쪽 끝으로 이동하거나 측면 정맥을 반대하는 바늘 (이상적으로 3 번 이상 시도)을 다시 삽입하십시오.</li>
		<li>소량의 혈액은 주사 후 대체 될 가능성이 높습니다. 멸균 거즈로 부드러운 압력을 가하고 무균 닦아 닦아냅니다.</li>
		<li>즉시 적절한 날카로운 용기에 주사기를 폐기하십시오.</li>
		<li>마우스를 깨끗하고 통풍이 잘 되는 케이지로 되돌리고 고통의 징후를 모니터링합니다.</li>
		<li>전이 형성의 징후 (노동 호흡, 구부러진 자세, 체중 감소) 및 일반적인 고민에 대한 마우스 2-3x / 매주 모니터링. 전이의 발달 시간은 세포주와 마우스 변형에 달려 있습니다.</li>
		<li>생체 내 살아있는 동물 영상 장치를 사용하는 경우, 화상 마우스는 세포의 성공적인 주입을 확인하고 시간 "제로"데이터를 얻기 위해 꼬리 정맥 주입 직후 (생체 내 생체 발광 화상 진찰에 대한 구체적인 세부 사항은 본원에 포함되지 않지만 양 외 24에 의해 설명된다).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 폐 조직 고정 및 전이성 폐 종양 부담의 분석
<ol><li>조직 병리학을 위한 폐의 구조적 형식을 유지하기 위한 폐 조직 인플레이션<ol>
<li>승인된 안락사 절차(예: 챔버 부피/분의 30-70% 변위)가 뒤따르고, 핀이 있는 해부판에 마우스 시체를 고정한다. 해부 중에 마우스의 털을 막기 위해 70%의 에탄올을 스프레이하거나 바르십시오. 참고: 이산화탄소 질식은 특히 느린 유량에서 예상되는 배경 병변으로 폐 출혈을 일으킬 수 있습니다.</li>
		<li>중음절절로 흉부를 열고 복막을 통해 절개/캐니드를 확대하고, xyphoid 과정을 파악하여 다이어프램을 잘라냅니다.</li>
		<li>별도의 가위를 사용하여 블레이드를 무디게하지 않고 흉골의 양쪽을 따라 갈비뼈를 자르고 조심스럽게 갈비뼈를 제거하여 폐가 확장 될 수있는 공간을 남겨 둡시하십시오.</li>
		<li>하안 타액 땀샘과 적외선 근골격계를 제거하여 기관지를 분리합니다. 기관의 양쪽에 핀을 배치하면 바늘 삽입 중에 원치 않는 움직임을 방지 할 수 있습니다.</li>
		<li>26 G 주사기를 2-3mL의 10% 중성 버퍼포름으로 채우고 기관지에 삽입한다.</li>
		<li>천천히 포르말린을 주입하고 폐가 팽창하는 것을 감시합니다 (일반적으로 포르말린의 ~ 1.5 mL이 필요합니다).</li>
		<li>포르말린이 폐에서 누출하기 시작하면 (인플레이션을 피하기), 한 쌍의 집게로 기관을 꼬집어 주사기 바늘을 제거하고 전체 호흡기 장치를 분리하십시오. 조직의 추가 트리밍이 수정 후 수행 할 수 있기 때문에 폐, 심장 등을 포르말린에 직접 배치하십시오.</li>
		<li>표준 방법을 사용하여 완전한 처리, 포함, 조직의 단면, 헤마톡시린 및 에오신 (H&E) 염색.</li>
	</ol></li>
	<li>전이성 폐 종양 부담 분석<ol>
<li>40배율의 고해상도 슬라이드 스캐너에서 H&E 염색 폐 단면을 스캔합니다(그림 3).</li>
		<li>폐 전이의 정량화를 위해 이미지 분석 소프트웨어(예: Visiopharm 이미지 분석)로 이미지를 가져옵니다. 참고: 새 사용자는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하기 위해 현장 또는 온라인 교육을 받는 것이 좋습니다. 수많은 웨비나 도 상용 웹 페이지를 통해 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>소프트웨어의 앱 라이브러리에서 Visiopharm 10118 H&E 폐 전이 앱을 선택합니다. 참고 : 이 응용 프로그램의 목적은 H&E 스테인드 슬라이드에 폐 전이를 표시하고 정량화하는 것입니다. 10118 H&E 폐 전이 앱의 일환으로, 첫 번째 이미지 처리 단계는 조직 검출 앱으로 폐 조직을 분할합니다. 두 번째 이미지 처리 단계는 폐 조직 내부의 전이를 식별하는 전이 감지 앱을 사용합니다. 전이는 전이로 식별되기에 대해 너무 잘못 모양이 있거나 너무 빨갛거나 너무 희소한 영역과 함께 모양을 통해 식별됩니다.</li>
		<li>모양과 희소성 을 정의하는 매개 변수를 조정하여 대표 이미지에 가장 잘 맞춥니다. 종양 전이 및 정상 폐 조직의 분할 영역은 각 조직 유형에 대해 상이한 색 레이블을 사용하여 표시될 수 있다. 참고: 앱이 정상 폐 조직과 전이를 정확하게 분리할 수 없는 경우, Visiopharm 결정 포리스트 프로그램을 사용하는 사용자 지정 앱은 실험에 대해 수행한 대로 작성해야 할 수 있습니다( 그림 2 및 그림 3 참조). 사용자 지정 알고리즘 작성에 대한 자세한 내용은 아래를 따릅니다. 그렇지 않으면 2.2.9 단계로 진행하십시오.</li>
		<li>원하는 이미지에 여러 클래스 (즉, 폐 조직 (비 신생물), 전이, 적혈구, 상피 및 / 또는 공백을 훈련하여 작동하는 결정 숲 프로그램을 엽니 다. 도 2에서 종양 전이는 파란색이고 정상 조직은 녹색이며 기관지 상피는 노란색입니다. 또한 적혈구는 빨간색과 공기 공간에 분홍색으로 되어 있습니다.</li>
		<li>이미지에 대한 각 클래스 를 적절하게 교육하기 위해 예 또는 아니오 질문의 프롬프트 시리즈를 따르십시오. 알고리즘의 정확도는 예/아니오 질문의 수를 결정합니다. 분석을 위해 사용자 지정 알고리즘/앱은 정확도를 50(범위 0-100 범위)으로 설정하여 작성되었습니다.</li>
		<li>알고리즘/앱의 정확도를 높이기 위해 필터를 적용하여 각 클래스의 기능을 조정하여 알고리즘/앱의 정확도를 향상시킵니다. 피처는 클래스가 이미지를 보는 방식을 변경하여 특정 색상이나 강도를 가져옵니다. 참고: 사용자 지정 알고리즘의 경우 8500 μm2 이상을 측정하는 전이가 전이로 표시되고 측정됩니다. 이것은 크기 차이를 차지하고 전이가 너무 작아서 감지할 수 없습니다. 8500 μm2 미만의 작은 모양의 영역과 작은 전이성 영역이 정상 조직 정량화에 포함되었다.</li>
		<li>앱 또는 사용자 지정 알고리즘에서 수정된 설정을 저장한 다음 알고리즘/앱을 전체 집합 또는 일련의 H&E 염색 조직에 적용합니다.</li>
		<li>마지막으로 표 1에 나열된 변수를 포함하는 모든 출력 변수를 내보냅니다. 미크론 제곱(μm2)의 면적은 각 조직 유형에 대해 정량화될 수 있으며 백분율은 표본 총 순 조직 영역(즉, 총 조직 마이너스 공공간)으로부터 유래된다.</li>
		<li>사용자 지정 알고리즘을 만들 때, 정확한 측정을 보장하고 조직 유형을 구별하기 위해 수의 병리학자 보드 인증 수의 병리학자와 협의하여 조직 마크업을 검토하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer.">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Wright, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+breast+cancer+bone+metastasis.">Murine models of breast cancer bone metastasis.</a> BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method.">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).</li><li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer.">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist.">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li><li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Microscopy,+Image+Analysis,+and+Virtual+Slide+Repository.">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

연구원이 전이를 위한 실험 모형으로 종양 세포의 정맥 주사를 계속 사용함에 따라, 결과전이성 종양 부담을 분석하는 표준 사례는 부족합니다. 경우에 따라 특정 세포주를 조작하거나 화학 화합물을 사용하는 경우 전이성 종양 부담의 현저한 차이를 거시적으로 관찰할 수 있다. 그러나, 다른 경우에, 전이성 파종 및 성장에 있는 미묘한 다름은 철저한 병리학 적인 분석 없이 간과되거나 잘못 해?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

매우 복잡하고 비효율적인 과정임에도 불구하고1, 전이는 암 환자의 이환율과 사망률에 중요한 기여이다2. 사실, 대부분의 암 관련 죽음은 질병의 전이성 퍼짐에 기인합니다3,4. 종양 세포가 성공적으로 전이되기 위하여는, 그(것)들은 1 차 적인 사이트에서 분리하고, 인접한 기질기를 통해 침략하고, 혈액 순환 또는 림프로 침입하고, 이차 사이트의 모세관 침대로 여행하고, 이차 조직으로 사치스럽게, 증식하거나 전이성 병변을 형성하기 위하여 증가하거나 성장해야 합니다. 마우스 모델의 사용은 전이성 파종 및 growth6,7을 담당하는 분자 메커니즘의 이해를 증진하는 데 매우 중요했습니다. 본명, 우리는 유방암 전이에 초점을 맞추고, 유전자 변형 마우스 모델뿐만 아니라 이식 방법이 종종 사용되는 - 장점과 한계의 자신의 세트와 각각.
유전자 조작 된 유방 종양 모델은 MMTV-LTR (마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복) 및 WAP (유청 산성 단백질)를 포함한 유방 선및 특정 프로모터를 사용하여 유방 상피8에서 트랜스 유전자의 발현을 유도합니다. 폴리마 중형 T 항원(PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 및 simian 바이러스 40(SV40)을 포함한 온코진은 이러한 방식으로 발현되었으며, 이러한 유전 적 모델은 1차 종양 개시 및 진행을 연구하는 데 유용하지만, 몇 가지 판독적으로 대사를 거친 장기에 대해 보다 쉽게 대사한다. 더욱이, 이러한 유전 마우스 모델은 종종 자발적 또는 실험 전이 모델보다 더 많은 시간과 비용이 금지된다. 전이를 연구하기 위해 대부분의 유전자 조작 된 유방 종양 모델의 한계를 감안할 때, 이식 기술은이 복잡한 과정을 연구하는 매력적인 방법이되고있다. 여기에는 직교, 꼬리 정맥, 심장 내 및 적합한 세포주의 두개 내 주입이 포함됩니다.
여러 유방암 세포주가 유방 지방 패드14,15로 직교 주입에 따라 쉽게 전이되지만, 전이성 종양 부담의 일관성과 재현성은 도전이 될 수 있으며, 이러한 연구의 기간은 몇 달의 순서에 있을 수 있습니다. 폐 전이를 평가하기 위해, 특히, 꼬리 정맥내의 정맥 주사는 종종 전이성 확산이 일반적으로 몇 주 내에 발생하는 보다 재현 가능하고 시간 효율적인 방법입니다. 그러나, 정맥 주사 모델은 전이성 캐스케이드의 초기 단계를 우회하기 때문에, 이러한 연구의 결과를 해석에주의를 기울여야한다. 이 데모에서는 정확하고 포괄적인 분석 방법과 함께 유방 종양 세포의 꼬리 정맥 주입을 보여줍니다.
연구 공동체가 유방암 전이의 복잡한 과정을 이해하는 데 상당한 진전을 이루었음에도 불구하고 현재 150,000명 이상의 여성이 전이성 유방암16을 가지고 있는 것으로 추정됩니다. 단계 IV 유방암을 가진 사람들의, >36% 환자의 폐 전이17이 있습니다; 그러나, 전이의 부위 별 패턴 및 발생률은 분자 하위타입18,19,20,21에 따라 달라질 수 있다. 유방암 관련 폐 전이를 가진 환자는 이 질병을 위한 효과적인 처리 및 새로운 biomarkers를 확인하는 필요를 강조하는 단지 21 달의 중앙 생존이 17. 종양 세포의 정맥 주사를 포함하여 실험적인 전이 모형의 사용은, 이 중요한 임상 도전의 우리의 지식을 계속 전진할 것입니다. 디지털 이미징 병리학 및 이 프로토콜 내에서 설명된 전이성 폐 종양 부담 분석 방법과 결합될 때, 꼬리 정맥 주사는 유방암 전이 연구를 위한 귀중한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>alcohol prep pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>&lt;strong&gt;for cleaning tail prior to injection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>dissection scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>&lt;strong&gt;for mouse dissection and lung tissue inflation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>used for resuspending tumor cells for injection</td></tr><tr><td>ethanol (70 % solution)</td><td>OSU</td><td></td><td>used to minimize mouse&#039;s fur during dissection; use caution - flammable</td></tr><tr><td>Evan&#039;s blue dye</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>cell culture media additive; used at 10% in DMEM</td></tr><tr><td>forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>for dissection and lung tissue inflation</td></tr><tr><td>FVB/NJ mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td>syngeneic mouse strain for MVT1 cells</td></tr><tr><td>hemacytometer (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>for use in cell culture to obtain cell counts</td></tr><tr><td>insulin syringe (28 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>for tail-vein injections (BD 329424)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>human breast cancer cell line</td></tr><tr><td>MVT1 cells</td><td></td><td></td><td>mouse mammary tumor cells</td></tr><tr><td>needles (26 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>used to inflate the mouse&#039;s lungs</td></tr><tr><td>neutral buffered formalin (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent</td></tr><tr><td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>cell culture media additive</td></tr><tr><td>sterile gauze</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>for applying pressue to mouse&#039;s tail if bleeding occurs</td></tr><tr><td>syringe (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>used to inflate mouse lung tissue</td></tr><tr><td>tail-vein restrainer</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>used to restrain mouse for tail-vein injections</td></tr><tr><td>Trypan blue (0.4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>used in cell culture to assess viability</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>used in cell culture to detach tumor cells from plate</td></tr></tbody></table>

pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells

대부분의 암 환자를 위한 이환율 과 사망의 1차 원인인 전이는 마우스에서 전임상적으로 모델링하는 것이 어려울 수 있습니다. 몇 가지 자발적인 전이 모델을 사용할 수 있습니다. 따라서, 적절한 세포주의 꼬리 정맥 주입을 포함하는 실험전이 모델은 전이 연구의 주축이다. 암세포가 측면 꼬리 정맥에 주입될 때, 폐는 식민지화의 그들의 바람직한 사이트입니다. 이 기술의 잠재적 인 제한은 전이성 폐 종양 부담의 정확한 정량화입니다. 몇몇 조사자는 사전 정의된 크기의 macrometastases를 계산하고 조직의 단면 다음 micrometastases를 포함하는 동안, 그 외는 일반적인 조직 지역에 근거를 둔 전이성 병변의 지역을 결정합니다. 이 두 정량화 방법 모두 전이성 부담이 높을 때 매우 어려울 수 있습니다. 본명, 우리는 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 전이성 종양 부담을 정량화하는 고급 방법에 이어 폐 전이의 정맥 주사 모델을 시연한다. 이 프로세스를 통해 평균 전이 크기, 총 전이 수 및 총 전이 영역을 포함한 다중 엔드 포인트 매개 변수를 조사하여 포괄적인 분석을 제공할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 정확도를 보장하기 위해 미국 수의병리학자(SEK)에서 인증한 수의병리학자 위원회에 의해 검토되었습니다.

꼬리 정맥 주사를 위해 표지가 없는 세포를 사용하는 경우, (1) 거세메타제가 관찰될 수 있는 경우 또는 (2) 현미경 전이가 존재하는 경우 내시경 분석 후 부검 시간까지 폐 식민지화를 확인하기 어려울 수 있다. 광범위한 전이성 폐 종양 부담으로 마우스는 호흡을 수고하게 됩니다. 어떤 종양 연구와 마찬가지로, 마우스는 주의 깊게 연구 기간 내내 감시되어야 합니다. 표지 된 세포의 사용은 성공?...

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Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.8K 조회수.  The Ohio State University Medical Center. 암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

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Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

폐 종양 세포 모집 분석 결과

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

연구

암 연구학

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

실험 전이 분석

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

의학

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopic 쥐 유 방 지방 패드 유방암 세포의 주입

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

동계 쥐 흑색 종 세포의 주입은 폐에서 그들의 전이성 잠재력을 확인하는 방법

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

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