이러한 프로토콜은 중요한 연구 도구 및 잠재적 치료법인 새로운 HAT 억제제의 효능 및 선택성을 검증하기 위한 상세한 단계를 제공하기 때문에 중요합니다. 이 비디오에서 입증 된 기술은 수행하기 쉽고 글로벌 및 지역 히스톤 아세틸화에 HAT 억제제의 효과에 대한 정보를 제공하기 쉽습니다. 그(것)들은 유전자 발현의 후성유전학 적인 규정을 이해하는 가능하게 합니다.
세부 사항에 대한 주의가 중요합니다. 프로토콜을 단계별로 따르는 것이 중요합니다. 원고 방향에 따라 0.2 밀리리터 PCR 튜브 내부의 10 마이크로리터 부피에서 효소 반응을 준비하는 것으로 시작합니다.
그런 다음 PCR 열 사이클러에서 1 시간 동안 섭씨 30도에서 전체 반응 혼합물을 배양합니다. 한편, 6X SDS 샘플 버퍼에 1 대 10 비율로 두 개의 mercaptoethanol을 추가합니다. PCR 열 사이클러에서 샘플을 제거하고 각 반응 믹스에 준비된 SDS 샘플 버퍼의 2개의 마이크로리터를 추가합니다.
시료를 열블록에서 5분간 섭씨 95도로 가열한 다음 얼음 위에서 식힙니다. 샘플을 영하 20도 또는 영하 80도에 저장하거나 겔 전기 전광 및 면역 blotting진행합니다. 종자 100, 000 MCF-7 세포는 세포 배양 배지의 1 밀리리터로 12웰 플레이트의 각 웰로 세포가 80 ~ 90%의 합류로 자랄 수 있도록 한다.
세포가 원하는 합류성에 도달하면, 3개의 마이크로몰러 MS275의 3개의 마이크로몰라 MS275의 4, 5 및 6, 및 파이펫 1 밀리리터에서 각각의 우물로 세포 배양 배지를 흡인한다. 그런 다음 세포 배양 배지를 1, 2, 3에서 흡인시키고 희석된 DMSO의 1밀리리터를 각각 양으로 배양한다. MS275에 노출된 세포에서 아세틸화 히스톤의 축적을 허용하기 위해 세포를 4시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다.
세포가 배양하는 동안 원고 방향에 따라 DMSO에서 A-485의 희석을 준비하십시오. 인큐베이션이 완료되면 우물에서 배지를 흡인하고 희석기를 추가합니다. 세포를 인큐베이터로 돌려보내 20시간 동안 배양한 다음 우물에서 세포 배양 배지를 흡인한 다음 PBS의 1밀리리터로 세포를 세척합니다.
PBS를 흡인하고 수동 리시스 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 하룻밤 동안 영하 80도에 접시를 보관하십시오. DMSO로 처리된 세포로부터 초음파 염색제 100마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브로 처리한 다음 각 튜브에 ChIP 희석 버퍼의 파이펫 400 마이크로리터를 각 튜브에 최대 500 마이크로리터까지 가져온다.
튜브 중 하나에서 용액 5 마이크로리터를 제거하고 DMSO 입력으로 섭씨 영하 20도에 저장합니다. 같은 방법으로 A-485로 처리 된 세포에서 초음파 염색질로 두 개의 튜브를 준비합니다. 파이펫을 사용하여 DMSO 및 A-485 샘플에 IgG 및 H3K27 아세틸 항체를 추가합니다.
그런 다음 각 튜브에 20 마이크로 리터의 단백질 A 자기 구슬을 추가하여 구슬이 잘 재중단되었는지 확인합니다. 하룻밤 사이에 샘플을 섭씨 4도에서 회전합니다. 단백질 자극제 마그네틱 구슬을 사용하여 자기 분리기와 구슬을 방해하지 않고 상퍼를 제거합니다.
500 마이크로리터로 구슬을 저염 세척 버퍼 1밀리리터로 씻고 섭씨 4도에서 5분간 회전합니다. 빠른 스핀 다운을 수행하고, 자석 분리기와 구슬을 펠릿과 상체를 제거합니다. 높은 소금 세척 버퍼, 염화물 세척 버퍼 및 TE 버퍼로 세척 절차를 반복하십시오.
TE 버퍼로 세척한 후 냉동고에서 입력 샘플을 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 단백질 제 K의 알리쿼트를 해동한 다음, 마그네틱 분리기로 구슬을 펠릿하고 구슬에서 TE 버퍼를 제거합니다. ChIP 용출 버퍼 100 마이크로리터와 1개의 단백질Ae K 마이크로리터를 입력 샘플을 포함한 모든 샘플에 추가하고 열순환기를 사용하여 2시간 동안 섭씨 62도에서 흔들림으로 배양합니다.
인큐베이션 후 샘플을 섭씨 95도로 10분 간 가열한 다음 실온으로 식힙니다. 자기 분리기로 자기 구슬을 펠렛하고 DNA함유 상체를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기다. 표준 PCR 정리 키트를 사용하여 DNA를 정화하고 qPCR을 실행합니다.
시험관 내 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 분석체는 기판을 향한 p300 HAT 활성에 대한 아나카르산의 효과를 조사하는 데 사용되었다. 농도 범위를 테스트하였고 아세틸-코아는 음의 대조반응에 첨가되지 않았다. 면역블롯 결과는 ImageJ로 정량화되었으며, DMSO 대조군과 비교하여 100 마이크로몰라 아나카르산에서 아세틸 H3K18 및 아세틸 H3K9의 명확한 감소를 나타냈다.
크로마틴 하이퍼 아세틸화 억제 분석에서 HDACi MS275를 가진 MCF-7 세포의 치료는 여러 리신 잔류물에서 히스톤 3의 아세틸화를 강력하게 강화하였다. 아세틸 H3K18과 아세틸 H3K27의 기저 수준은 낮았으며 ChHAI 분석에서 HDACi를 추가하는 이점을 보여 주면서 나타났습니다. MS275로 전처리된 세포에 A-485를 첨가하면 H3K18 및 H3K27에서 히스톤 아세틸레이션이 증가했지만 H3K9는 그렇지 않다.
면역블롯 결과도 ImageJ로 정량화되었다. ChIP qPCR은 종양 유전자 발현을 제어하는 유전자 조절 원소에서 HAT 억제제의 효과를 조사하는 데 사용되었습니다. DMSO 샘플에서, IgG 대조군 항체에 의해 침전된 DNA는 사이클린 D1 프로모터에 대한 qPCR 반응에서 아세틸 H3K27 항체보다 더 높은 Ct 값을 생성하여, 비특이적 IgG 대조군이 아세틸 H3K27 특이적 항체보다 적은 DNA 히스톤 복합체를 침전시켰다는 것을 나타낸다.
DMSO 대조군과 비교하여, A-485는 사이클린 D1 프로모터에서 아세틸 H3K27 농축을 감소시켰습니다. 중요한 것은, A-485는 세포 배양에서 아세틸 H3K27을 현저히 감소시키는 것으로 알려져 있다. 이 프로토콜을 시도할 때, 시험관 내 HAT 및 ChHAI 분석의 사전 인큐베이션 단계는 필수적이며 잊혀서는 안된다는 것을 명심하십시오.
또한 입력 샘플을 저장하고 ChIP 중에 구슬이 손실되는 것을 방지하는 것도 중요합니다. 이러한 절차를 수행한 후 ChIP-seq는 전체 게놈에 대한 조절 원소에서 히스톤 아세틸화에 대한 글로벌 정보를 얻기 위해 실행할 수 있는 추가 방법입니다. 이러한 프로토콜은 과학자들이 새로운 HAT 억제제의 유효성을 신중하게 검증하고 문헌에 저품질 화학 프로브를 게시하지 않도록 하는 데 유용합니다.
검증된 HAT 억제제는 잠재적인 치료제로서 추가 개발을 거칠 수 있습니다.
