이 기술은 반응체 항원 태그 DNA 부가물 조우의 시각화를 용이하게 하고 면역검출이 가능한 DNA 구조 또는 병변을 가진 모든 단백질의 상호 작용으로 확장될 수 있습니다. 이 방법은 집단 전체가 아닌 개별 세포 내에서 상호 작용 빈도를 평가하는 데 사용할 수 있으며 세포를 손상시키지 않고 현장에서 세포주기 의존적 상호 작용을 시각화할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Seidman Laboratory의 박사후 연구원 인 Ishani Majumdar가 될 것입니다.
실험 전날에, 세포 접착제 용액으로 전처리된 35 밀리미터 유리 바닥 배양 접시 위에 2 밀리리터의 배지에서 1.5배 10 내지 5번째 세포를 시드하였다. 다음날, 각 접시 내의 상청액을 섭씨 37도 50 내지 70% 융합 세포 배양액으로 섭씨 37μmol Dig TMP 보충 배지로 교체하고, 플레이트를 Dig TMP가 평형을 이루도록 30분 동안 세포 배양 배양기로 되돌린다. 세포가 배양되는 동안 UV 상자를 섭씨 37도까지 예열합니다.
평형이 끝나면 플레이트를 예열 된 상자로 옮겨 세포를 5 분 동안 제곱 센티미터 당 3 줄의 UVA 광 선량에 노출시키고 상청액을 2 밀리리터의 신선한 예열 된 배양 배지로 교체한 후 플레이트를 1시간 동안 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 배양이 끝나면 배양물을 PBS로 부드럽게 세척하고 실온에서 5분 동안 PBS에 0.1% 포름알데히드 1밀리리터로 세포를 고정합니다. 배양이 끝나면 PBS로 세포를 1회 세척한 후 RNase가 보충된 80 마이크로리터의 세포골격 추출 완충액으로 2회 처리하여 실온에서 5분간 처리하여 세포질을 제거하였다.
2차 배양 후, 실온에서 10분 동안 PBS에 4%포름알데히드 1밀리리터로 세포를 고정하기 전에 2밀리리터의 PBS로 세포를 3회 세척한다. 2차 고정 후, 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 섭씨 영하 20도에서 20분 동안 1밀리리터의 차가운 100% 메탄올로 처리하였다. 인큐베이션이 끝날 때, 세포를 2밀리리터의 PBS로 3회 세척한 다음, 섭씨 4도에서 80마이크로리터의 5밀리몰 트리톤 X-100에서 10분간 인큐베이션하였다.
배양이 끝나면 섭씨 37도에서 30분 동안 100밀리리터의 RNase A를 보충한 PBS 중 100마이크로리터의 5밀리몰 EDTA로 세포를 처리합니다. 배양이 끝나면 PBS에서 세포를 세 번 세척한 후 섭씨 4도의 습한 챔버에서 PBS의 5% 소 혈청 알부민과 10% 당나귀 혈청에 보관합니다. 근접 결찰 분석을 수행하기 위해 관심 있는 1차 항체 용액 40마이크로리터를 각 플레이트의 중앙에 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 습한 챔버에서 플레이트를 배양합니다.
배양이 끝나면 세포 배양 배양기에서 1시간 동안 배양하기 전에 2밀리리터의 PBST로 세포를 3회 세척한 후 각 접시에 새로 제조된 PLA 프로브 용액 40마이크로리터를 첨가합니다. 인큐베이션이 끝날 때, 실온에서 틸팅 플랫폼 상에서 2 밀리리터의 완충액 A에서 3 회 10 분 세척으로 세포를 세척하십시오. 마지막 세척 후, 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하기 위해 각 플레이트에 40마이크로리터의 갓 준비된 결찰 혼합물을 첨가한 다음, 틸팅 플랫폼의 버퍼 A에서 2분 동안 3회 세척합니다.
마지막 세척 후, 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 100 분 배양을 위해 각 플레이트에 40 마이크로 리터의 갓 준비된 증폭 용액을 첨가하십시오. 인큐베이션의 종료시에, 틸팅 플랫폼 상에서 세척 당 10분 동안 신선한 완충액 B로 세포를 6회 세척한다. 마지막 완충액 B 세척 후, 섭씨 37도에서 30분 동안 습윤 챔버에서 적절한 2차 항체로 표지하기 전에 실온에서 1분 동안 0.01x 완충액 B로 세포를 1회 세척합니다.
배양이 끝나면 샘플을 실온에서 PBST의 틸팅 플랫폼에서 10분 동안 3회 세척한 후 DAPI가 보충된 장착 배지에 장착합니다. 장착 후 4일 이내에 실험 및 대조 시료 모두에 대해 동일한 노출 설정을 사용하여 에피형광 또는 컨포칼 현미경에서 시료 또는 컨포칼 현미경으로 시료 또는 상태 세포당 최소 100개의 관찰 결과를 이미지화합니다. Dig 태그는 면역형광으로 시각화하여 핵 전체에 걸쳐 가닥 간 가교결합의 존재를 나타낼 수 있습니다.
가닥 간 가교 결합과 리플리솜의 상호 작용을 시각화하기 위해 PLA를 적용하여 가닥 간 가교 도입 1시간 후 MCM5와 Dig 태그의 결합 빈도를 시각화할 수 있습니다. 복제 스트레스가 ATR 키나제를 활성화함에 따라, pMCM 2개의 세린 108과 Dig 태그 사이의 PLA도 양성이다. 개별 핵의 PLA 결과는 3차원 재구성으로 제시되어 핵 전체에 걸쳐 가닥 간 교차 연결 만남을 시각화할 수 있습니다.
Replication Fork 분석은 GINS 복합체의 단백질이 가닥 간 가교와 PLA 신호를 나타내지 못하기 때문에 가닥 간 교차 링크 만남이 예기치 않은 복제 재시작 현상을 나타낸다는 것을 나타냅니다. 대조적으로, CD 45를 사용한 분석은 양성이며, 이는 다른 잠금 단백질이 유지됨을 나타냅니다. 세포가 ATR 억제제와 함께 배양되면 재시작이 완전히 억제되고 GINS Dig PLA가 강력하게 양성입니다.
CSK+R 치료는 배경 신호를 줄이는 데 필수적입니다. 플레이트에 셀 접착제를 코팅하고 0.1% FA 접두사를 붙이지 않으면 셀이 플레이트에서 벗겨집니다.
