이 방법은 세포 간 상호 작용과 지방 조직 생리학이 금식과 비만과 같은 다른 신진 대사 조건에 어떻게 변화하는지와 같은 지방 생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 원래 지방 3D 구조를 최적으로 보존하고 통상적인 면역 조직 화학에 일반적으로 필요한 긴 처리 단계를 피한다는 것입니다. 이 방법은 지방 조직의 구조에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 뇌를 염색 하는 전체 마운트에 의해 신경계와 같은 다른 장기 시스템에도 적용 될 수 있습니다.
일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 속성 조직 사이트를 얻기에 어려움 때문에 투쟁 할 것 이다, 적절 한 고정 기간을 찾는, 그리고 최적의 항체 농도. 해부가 완료된 후, 1시간 동안 얼음에서 실온으로 1%파라포름알데히드에 티슈 샘플을 함유한 접시를 옮는다. 그런 다음 조직을 12 또는 24웰 세포 배양 판으로 이송하여 더 빠른 세척을 합니다.
전체 마운트 염색 절차는 해부 직후에 시작해야 하며 각 단계 사이에 일시 중지 점이 없다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. PBS-0.3T로 티슈를 22도기울어실온에서 분당 20~25°C의 속도로 5분간 세척합니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.
그 후, 5%의 동물 혈청을 포함하는 블로킹 버퍼의 약 0.5~1밀리리터를 추가합니다. 이전 조건을 사용하여 셰이커에 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 차단 용액을 흡습하고 PBS-0.3T에서 희석된 1차 항체의 밀리리터를 각각 1%의 동물 혈청으로 첨가한다.
22도의 기울기와 분당 20 ~25 기울기의 속도로 4 섭씨에서 셰이커에 밤새 접시를 배양. 다음 날 PBS-0.3T를 사용하여 실온에서 5 분 동안 조직을 씻으실 수 있습니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.
그런 다음, 각각의 우물에 적절하고 희석된 이차 항체 솔루션의 0.5 와 1 밀리리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 감싸고 실온에서 셰이커에 1시간 동안 배양합니다. 그 후 실온에서 PBS-0.3T로 플레이트를 2회 세척하여 세척당 5분간 세척합니다.
중성 지질 얼룩 중에 액체 방울의 시각화가 필요한 경우, 5 분 동안 지속 각 세척1x PBS로 두 번 세척하십시오. PBS에서 희석된 중성 지질 얼룩을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이미징을 시작하려면 집게를 사용하여 조직을 24 x 60mm 유리 커버 슬립에 평평하게 놓습니다.
DAPI로 염색하는 핵이 바람직한 경우, 조직을 완전히 침수하고 건조를 방지하기 위해 DAPI를 포함하는 마운팅 매체의 1 ~ 2 방울을 추가합니다. 그런 다음 슬라이드를 반전된 공초점 레이저 현미경 시스템에 배치합니다. 여러 초점 평면에서 전체 마운트 스테인드 조직의 이미지를 얻으려면 원하는 배율에서 4 ~ 6 마이크로 미터의 단계 크기로 깊이 100 내지 150 마이크로미터의 Z 스택을 수행하십시오.
이 연구에서는, 전체 탈염 염색은 지방 조직 아키텍처를 보존하기 위하여 이용됩니다. 다중 처리 단계와 단면화를 수반하는 방법과 달리, 이는 지방 조직 형태의 손상으로 이어질 수 있으며, 전체 마운트 염색 방법은 결과를 해석할 때 정확성을 보장하면서 지방 세포의 형태를 보존할 수 있습니다. 지방 조직의 과고착은 고정 유도 형광으로 이어지며, 이는 여기에서 볼 수 있는 티로신 하이드록실라제 및 PECAM-1 신호와 같은 동일한 영역을 겹쳐서 표시될 수 있다.
제대로 고정, 전체 마운트 얼룩 샘플, 그러나, 별도의 별개의 신호를 표시, 이러한 신호가 자가 형광이 아니라는 것을 나타내는. 이미징 전체 마운트 스테인드 지방 조직은 다른 실험 조건하에서 형태학적 변화의 정량화를 허용합니다. 특히, 지방 조직은 에너지 레벨의 급격한 변화에 따라 대사 의 항상성을 중재하는 데 중요한 혈관이 높게 조직된다.
예를 들어, 24시간의 금식을 겪는 C57 블랙 6J 마우스는 lipolysis를 나타내는 상당히 작은 홍포세포 크기를 표시하고, 지속적으로 공급되는 마우스와 비교할 때 혈관 밀도가 상승하는 추세를 나타낸다. iDISCO+로 지방 조직을 지우면 지방 조직이 광학적으로 투명해질 수 있습니다. 조직 정리를 통해 간 지방 조직의 면역 라벨링은 동일한 배율에서 조직 클리어링없이 전체 마운트 염색에서 관찰된 것에 비해 훨씬 조밀한 신경 절기를 나타낸다.
이 절차를 시도하는 동안 PFA의 실온에서 1 시간 이상 샘플을 과대화하지 않는 것이 중요합니다. 그러나 샘플이 섭씨 4도로 고정되면 이 고정 기간이 연장될 수 있습니다. 이 절차에 따라 ImageJ를 이용한 정량화와 같은 다른 방법은 형포 부위 및 혈관 밀도와 같은 세포 구조가 다양한 생리적 조건에 대한 응답으로 변화하는 방법과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수 있습니다.
