자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

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06:09 min

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February 2nd, 2021

DOI :

10.3791/62062-v

February 2nd, 2021

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Darren M. O'Hara¹^,², Minesh Kapadia¹^,², Susan Ping¹^,², Suneil K. Kalia¹^,²^,³, Lorraine V. Kalia¹^,²^,⁴^,⁵^,⁶

¹Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, ²Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, ³Department of Surgery, Division of Neurosurgery, University of Toronto, ⁴Department of Medicine, Division of Neurology, University of Toronto, ⁵Department of Medicine, Division of Neurology, Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease and the Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Clinic, Toronto Western Hospital, University Health Network, ⁶Tanz Centre for Research in Neurodegenerative Diseases, University of Toronto

필기록

실질적인 니그라에서 도파민성 뉴런 수의 추정은 파킨슨 병 연구에서 중요한 결과 척도입니다. 이 프로토콜은 뉴런 수를 추정하는 데 필요한 워크로드를 크게 단축합니다. 이 방법은 도파민성 뉴런 수의 변화를 검출하기 위한 시간 효율적이고 정확한 프로세스를 제공하며 세포 생존에 대한 내정간섭의 영향을 결정하는 데 적합합니다.

이 방법은 전통적인 입체 적 방법에 비해 비용과 시간 이점을 유지하면서 다른 뇌 영역에서 뉴런의 정확한 수를 제공하기 위해 쉽게 적응 할 수있다. IHC 이미지를 캡처하려면 10배배율의 공초점 현미경에 결합된 소프트웨어를 사용합니다. 핀 구멍을 1.5 개의 영역 단위로 열어 총 1.5 마이크로 미터의 넓은 평면을 캡처하고 뇌의 주입 된 측면에 초점을 설정합니다.

수집 탭에서 타일 스캔 이미징 옵션을 확인하고 치수를 10x 4로 설정합니다. 획득 모드 패널에서 확대/축소를 1.1로 설정하여 타일 스캔 이미지 사이의 스티치 마크를 피합니다. 프레임 크기를 1024x 1024픽셀로 설정하고 평균2픽셀로 설정하여 고품질 이미지 수집을 보장합니다.

채널 패널 세트 알렉사에 하나를 트랙 488 알렉사 에 두 트랙 555. 슬라이드를 스테이지에 로드하고 TH 염색이 강한 단면을 선택합니다. 획득 패널에서 라이브를 클릭합니다.

채널 패널에서 레이저 강도를 설정하고 신호를 최대화하고 배경 소음을 제한하는 수준으로 게인. 범위 표시기를 사용하여 신호가 과도하게 노출되지 않았는지 확인합니다. 여러 슬라이드로 반복합니다.

획득 탭에서 위치 확인란을 선택합니다. 이미징을 시작하려면 눈조각을 사용하고 긍정적 인 TH 염색을 보여주는 첫 번째 섹션을 선택하십시오. 그런 다음 관심 지점에서 포커스를 설정하고 스테이지를 섹션의 중간선으로 이동합니다.

이렇게 하면 X, Y 및 Z 축의 위치를 저장하고 전체 섹션을 캡처하는 타일 스캔을 이미지화합니다. 주입되지 않은 사이트를 포함한 다른 모든 슬라이드에 대해 이 작업을 반복합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 분리하고 자동화된 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.

펜 어음 도구를 선택하여 실질적인 니그라 파스 콤팩트를 중심으로 음표기를 그려 관심 영역을 정의합니다. 분석 탭으로 이동하여 드롭다운 분석 메뉴에서 실시간 튜닝을 선택합니다. 이렇게 하면 섹션 이미지의 별도의 창이 열리므로 분석 매개 변수를 실시간으로 수정할 수 있습니다.

분석 배율 섹션에서 적절한 이미지 줌을 선택합니다. 세포 검출 섹션에서 는 TH 염색에 사용되는 염료로서 핵 염료를 선택합니다. 핵 대비 임계값, 최소 핵 강도, 핵 세분화 공격성 및 핵 크기 설정을 신중하게 조정하는 동시에 시간을 조정합니다.

여러 샘플로 이 프로세스를 반복합니다. 적절한 수의 이미지를 샘플링하고 실시간 튜닝이 조정되면 설정 동작 드롭다운 메뉴의 분석 설정을 저장합니다. 분석할 모든 이미지를 선택하고 분석을 클릭합니다.

방금 저장된 분석 설정을 선택하고 분석 창 영역에서 별표 레이어 상자를 확인한 다음 레이어 를 확인하고 분석을 클릭합니다. 완료되면 개체 분석 데이터를 내보내는 옵션을 선택하여 모든 섹션에 대한 요약 분석 데이터를 내보냅니다. 이 데이터 세트는 독소 또는 치료에 반응하여 세포 크기의 변화를 검사하는 데 사용될 수 있었다.

아데노 관련 바이러스 또는 AAV 주사 후 6 주, 쥐 뇌의 실질적인 니그라로 돌연변이 A53T 알파 시뉴클레인을 표현하는 AAV의 입체 주사는 도파민 성 뉴런의 밀도가 현저한 감소귀착되었다. AAV-A35T로 주입된 쥐의 실질적인 니그라에서 제곱된 밀리미터당 TH 양성 뉴런의 평균 수는 AAV 빈 벡터로 주입된 쥐의 평균 감소와 비교하여 현저히 감소하였다. 유사한 관찰은 편견없는 입체학을 사용하여 이루어졌다.

이 프로토콜을 시도할 때 소프트웨어는 교육을 받은 만큼만 유용합니다. 따라서 단일 셀이 단일 셀로 식별되도록 시간과 주의를 기울여야 합니다. 이 소프트웨어는 알파 시뉴클레인과 같은 다른 관심사 단백질의 형광 강도를 측정하여 치료가 단백질 수준을 조절할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 조정할 수 있습니다.

이 기술은 도파민저기 신경 밀도에 대한 여러 잠재적 치료법의 효과를 테스트 할 때 더 큰 효율성을 허용했습니다.

요약

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Introduction

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Confocal Microscopy and Image Acquisition

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Image Analysis and Quantitation

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