FASP 프로토콜은 강하게 데스팅 버퍼와의 호환성과 희석 된 단백질 샘플에 중요한 필터에 샘플을 집중하는 능력 때문에 오줌 프로테오믹스에 대한 흥미로운 접근 방식입니다. FASP 프로토콜은 데이터 독립적 인 분석 질량 분석과 결합하여 디지털 직장 검사 후 수집 된 소변인 EPS 소변에서 깊은 프로테아메 커버리지를 달성 할 수 있습니다. 우리는 현재 전립선암에 대한 바이오 마커 발견 노력에서 보려고하는 방법을 적용하고 있습니다.
절차는 리시아 Prestagiacomo, 파올라 모렐리와 카테리나 가브리엘에 의해 표시됩니다. 원심분리기 EPS-소변 샘플은 실온에서 2, 100 RCF에서 10분 동안 수집된 2시간 이내에 샘플링합니다. 그런 다음, 슈퍼 네이티드를 영하 80도까지 저장하면 사용까지 저장합니다.
샘플을 얼음 위에 던지거나 4도에서 던지시면 됩니다. 절차를 가속화하기 위해 소화 전날 샘플을 마이너스 80에서 영하 20으로 전송할 수 있습니다. 재고 솔루션으로, 당신은 500 밀리머 DTT, 10 %SDS, pH 8에서 하나의 어금니 트리 버퍼가 필요합니다.
SDS의 67 마이크로리터, DTT의 67 마이크로리터 및 Tris 버퍼의 33 마이크로리터로 각 EPS 소변 샘플의 500 마이크로리터를 희석시 희석시. 95도에서 10분간 부드러운 흔들림으로 배양하세요. 원심 필터 유닛을 10, 000 달튼 분자량이 잘라내어 조립합니다.
그런 다음, 필터에 희석 된 EPS 소변 샘플300 마이크로 리터를 추가합니다. 14, 000g의 원심분리기는 약 20분간. 여과가 원활하게 진행되고 있는지 확인하기 위해 15분 정도 후에 절차를 일시적으로 중단할 수 있습니다.
전체 솔루션이 필터를 통과할 때까지 계속합니다. 그런 다음 15분 동안 14, 000g에 200마이크로리터의 우레아 완충제와 원심분리기를 추가합니다. 이 단계를 두 번째로 반복합니다.
흐름 스루가 필터를 터치하려고 할 때, 흐름 을 피펫하여 컬렉션 Eppendorf를 비웁트. 단백질은 필터에 안전합니다. 시스테인 알킬레션의 경우 사용 직전에 요오도아세타미드 용액을 준비하십시오.
에페도르프 바이알에서 약 10밀리그램의 요오도아세타미드를 계량하고 ml당 9.25 밀리그램의 농도또는 50 밀리머의 농도로 우레아 버퍼에 녹입니다. 각 필터에 50마이크로리터의 요오도아세다미드 솔루션을 추가하고 원심분리기는 6, 000g에서 25분간 추가합니다. 낮은 원심 분리 속도는 필터가 건조하게 실행되지 않도록 합니다.
단백질 알킬레이션 후, 20분 동안 14, 000g에서 우레아 완충제와 원심분리기의 200 마이크로리터 알리쿼트로 필터를 세척합니다. 흐름을 삭제합니다. 50 밀리머3에 틸 암모늄 중탄산염 완충제와 원심분리기의 200 마이크로리터를 14, 000g에서 20분간 추가합니다.
이 단계를 반복합니다. 마지막 중탄산수 세척을 완전히 완료한 후 필터 장치를 새로운 수집 튜브로 옮겨 넣습니다. 그런 다음 50 밀리머 TEAB 버퍼의 60 마이크로 리터를 추가합니다.
트립신의 마이크로 리터 당 200 나노 그램의 농도에 트립신 용액의 마이크로 리터 를 추가합니다. 또는 Eppendorf 바이알의 모든 샘플에 대한 소화 버퍼를 준비하고 각 필터에 소화 버퍼 61 마이크로리터를 배포할 수 있습니다. 하룻밤 동안 배양 중에 시료 증발을 피하기 위해 ThermoMixer를 사용하는 경우 각 필터 장치를 알루미늄 호일 층으로 감싸고 파라필름 층을 감쌉니다.
하룻밤 사이에 37도에서 샘플을 배양합니다. 다음 날 아침, 매우 짧은 스핀을 위해 필터를 벤치 상단 원심분리기로 옮기. 회전 후 Eppendorf 뚜껑을 열고 140 마이크로리터의 물을 추가합니다.
펩티드를 수집하기 위해 바이알을 14, 000g에서 25분간 원심분리합니다. 수집된 부피는 약 190마이크로리터여야 합니다. 소화로부터 SDS의 흔적을 제거하기 위해 LC-MS-MS 전에 펩타이드의 강력한 양이온 교환 정화를 권장한다.
핀셋이나 가위와 같은 날카로운 도구로 에펜도르프 뚜껑을 관통하여 마이크로 컬럼 홀더를 준비합니다. 홀더는 원심 분리 중에 마이크로 컬럼을 수용할 수 있습니다. 그들은 준비하는 지루한 때문에, 홀더는 여러 번 활용할 수 있습니다.
무딘 바늘과 바늘을 사용하여 적절한 추출 디스크의 플라크를 제거하십시오. 추출 디스크는 흡착 입자를 포함하는 부드러운 중합체 물질입니다. 이 경우, 소벤트는 강한 양이온 교환 특성을 가진 입자로 만들어집니다.
플라크를 200 마이크로리터 파이펫 팁으로 넣습니다. 피스톤을 사용하여 플러그를 팁 끝으로 밀어 넣습니다. 작은 디스크는 단단히 밀어해야하지만 과도한 강도를 피해야합니다.
팁을 홀더에 삽입하고 원래 뚜껑이 제거된 2밀리리터 Eppendorf 바이알을 사용하여 스핀 마이크로컬럼을 조립합니다. 게이지 16 바늘의 플러그는 약 5 마이크로 그램의 펩티드의 적재 용량을 가질 것입니다. 마이크로컬럼을 연속 2회 연속으로 조절합니다.
적절한 속도는 디스크를 파이펫 팁에 얼마나 강하게 밀어 넣는지에 따라 달라집니다. 분당 20~30마이크로리터의 순으로 유량량을 달성하는 것을 목표로 합니다. 세탁 중과 시료 하중 중에 팁을 건조하게 실행하지 않도록 하십시오.
세척 용액 2에서 샘플을 5 배 희석하고 느린 속도로 용액을 로드합니다. 분당 약 15~20마이크로리터의 유량을 목표로 합니다. 필요한 경우 흐름 스루를 폐기합니다.
잔류 세제를 씻어내라. 그런 다음, 디스크가 펩티드 용출 전에 건조하게 실행되도록 한다. 마이크로 컬럼을 깨끗한 1.5 Eppendorf 튜브로 옮기고 즉시 용액을 추가합니다.
이는 20%의 아세토닐릴을 함유한 500 밀리머암모늄 아세테이트 용액의 7개의 마이크로리터가 될 것입니다. 유기 용매의 비율을 낮추기 위해 0.1 %의 27 마이크로 리터로 용액을 희석한 다음 데이터 종속 모드에서 검출된 LC-MS-MS에서 결과 용액의 2 마이크로리터를 주입합니다. 이 프로토콜에 사용된 LC-MS 설정에 대한 자세한 내용은 비디오의 나중에 제공됩니다.
데이터베이스 검색 및 펩타이드 오류 통합을 수행한 후 전체 피크 영역을 계산합니다. 이어서, FASP 다이제스트에서 펩티드 농도를 추정하기 위해 외부 표준 곡선과 비교한다. 펩티드 양을 추정한 후, 여기에 설명된 바와 같이 2개의 연속 StageTip 정제에 의해 펩티드의 2마이크로그램에 대응하는 FASP 다이제스트의 새로운 알리쿼트정제.
이 프로토콜에 사용되는 LC-MS 설정은 분석 열에 직접 주입을 기반으로 합니다. 트래핑 열이 있는 시스템을 사용하는 경우 오프라인 C18 정화 단계를 피할 수 있습니다. 각 크로마토그래피 소재에 전용 바늘과 피스톤을 사용하는 것을 기억하십시오.
C18 단계 팁에서 10 마이크로리터의 용액을 용액으로 용출한 후, 진공 원심분리기에서 용출을 몇 분 동안 부분적으로 증발하여 완전한 증발을 피하려고 노력합니다. 그런 다음 0.1%의 포름산의 47마이크로리터를 추가하고 LC-MS 분석을 위한 HPLC 바이알에 그 결과 용액을 배치합니다. 여기서 사용되는 시스템은 트랩 열을 사용하지 않고 열 샘플 로딩을 직접 기반으로 합니다.
분석 컬럼은 폴리아미드 코팅 조각을 제거한 후 75마이크로미터 ID 모세관을 당겨 사내 로 만들어집니다. 결과 팁은 세라믹 커터로 부드럽게 형성될 수 있습니다. 모세관은 포장 폭탄에 넣고 C18 3 마이크로 미터 고정 상 입자의 ml 이소 프로판올 슬러리 당 50 밀리그램으로 포장됩니다.
질소 또는 헬륨 의 10 그리고 20 막대 사이 가스 압력이 필요합니다. 분당 서브 마이크로리터에서 실행되는 대체 또는 상업용 크로마토그래피 컬럼을 사용할 수 있습니다. T피스에 열을 조립합니다.
다른 두 단단은 고전압 전원 공급 장치 및 HPLC 루프에 연결됩니다. 동위 유동에서 시스템을 실행하여 최적의 스프레이 전압을 평가합니다. 그런 다음 분석을 시작합니다.
표시된 대로 2시간 길이의 크로마토그래피 그라데이션을 통해 펩티드를 분리합니다. 데이터 수집은 빠른 전체 MS 서비스 스캔과 가변 너비의 전구체 창에서 26개의 MS-MS 스캔으로 구성됩니다. 20m/z 너비에서 시작하여 M/z 범위를 350~750Thompson으로 커버할 수 있는 처음 20개의 창문을 위한 것입니다.
그런 다음 50m/z 너비로 이동하여 다음 5개의 창을 위해 MS-MS 스캔을 하나만 사용하여 격리 폭이 200Thompson으로 끝납니다. 좁은 폭은 펩티드 전구체의 존재 측면에서 스펙트럼의 더 인구가 많은 영역을 차지합니다. DIA 분석을 위해서는 스펙트럼 라이브러리가 필요합니다.
스펙트럼 라이브러리를 생성하기 위해 동일한 크로마토그래피 그라데이션을 사용하여 DIA 획득에 사용했던 것과 동일한 LC-MS-MS 시스템에서 몇 가지 데이터 종속 실험을 수행할 수 있습니다. 샘플 분획은 프로테오메 커버리지를 증가시게 됩니다. 단계 팁은 샘플 분수에 사용할 수 있습니다.
강력한 양이온 교환과 기본 역단계는 두 가지 유효한 대안입니다. 여러 FASP 다이제스트 풀의 10 마이크로그램으로 시작합니다. 0.2%TFA 최종 농도를 사용하여 시료를 산성화합니다.
대용량 C18 스테이지 팁에 펩티드를 적재합니다. 펩티드 양이 많은 경우 여러 디스크를 사용하십시오. 10 마이크로그램의 재료의 경우 두 개의 디스크를 권장합니다.
이전에 설명한 바와 같이 C18 정제를 수행한다. 용액 컬렉션을 위해 여러 개의 바이알을 준비합니다. 분수 수만큼.
이 경우 10분획은 단계별 용출에 의해 생성됩니다. 마지막 세척 후 첫 번째 용액의 마이크로리터 20대를 추가합니다. 수산화 암모늄 0.2%, 밀리머티브 10개, 아세토닐레 4%.
첫 번째 Eppendorf에서 첫 번째 부분을 완전히 발례한 후 스테이지 팁을 다음 컬렉션 바이알로 이동합니다. 용광로 20 마이크로 리터 단계에서 희석, 암모늄 수산화의 0.2 %, 10 밀리머 티B, 다음 아세토나이트의 양을 증가. 샘플을 분수하고 각 분획에 대한 데이터 종속 실험을 실행한 후 MS-MS 데이터를 데이터베이스 검색하여 스펙트럼 라이브러리를 생성합니다.
라이브러리는 최소 3개의 전환에 의해 할당된 하나의 고유 펩타이드에 기초하여 단백질 정량화를 위한 DIA 데이터 분석을 할 수 있는 소프트웨어에서 가져옵니다. 오줌 프로테오메의 넓은 범위를 커버 할 것으로 예상. 이 수치는 5배의 크기에 걸친 풍부한 범위에 걸쳐 단백질의 식별 및 정량화를 보여줍니다.
여기서 제시된 워크플로우는 FASP 프로토콜의 농도 이점과 다재다능함과 DIA 스캐닝 모드의 감도를 결합합니다. 이 조합은 오줌 프로테오메의 풍부한지도를 제공합니다. 분석 설정에는 트랩프럼의 사용이 포함되어 있지 않기 때문에 FASP 다이제스트는 강력한 양이온 교환과 반전된 위상 단계 팁 모두에 의해 정제되었습니다.
트래핑 열이 분석 열에 직접 연결되면 반전된 단계 단계 팁 단계를 생략할 수 있습니다. 이 워크플로우의 사용은 EPS 소변 샘플을 분석하는 데 권장되지만 일반적으로 오줌 프로테오믹으로 확장 할 수 있습니다.
