단백질 단백질 상호 작용을 연구하는 것은 몇몇 필드에 있는 생리적인 과정을 이해하기 위한 필수불가결합니다. 이 비디오에서는 연구원이 MS에 의한 결합 단백질에 대한 포괄적인 분석을 편리한 방식으로 수행할 수 있는 온멤브레인 소화 기법을 소개합니다. 이 기술의 주요 장점은 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의한 단백질의 분리가 필요하지 않기 때문에 조잡한 면역 침전제에 대한 프로테오믹 분석의 처리량을 향상시킬 수 있다는 것이다.
항체를 자기 구슬에 결합하기 시작하여, 구연산 인산염 완충제의 500 마이크로리터에 구슬과 항GFP 항체를 혼합하여. 실온에서 1시간 동안 50 RPM에서 혼합물을 회전시합니다. 그리고 1%폴리소르바트(20)를 함유한 구연산염 완충액으로 공주구비드를 세 번 세척한다.
Lyse 원고 지침에 따라 감염된 세포를 분리합니다. 접시를 긁어 1.5 밀리리터 테스트 튜브로 lysate을 옮킨다. 그런 다음 15, 000 x g에서 원심분리로 lysate를 5 분 동안 지우고 상체를 수집합니다.
구연산인산염 완충제 500마이크로리터로 세 번 세척하여 라벨이 없는 자기 구슬을 준비합니다. 마지막 세척 후 버퍼를 제거하고 구슬에 셀 리세이트를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 50 RPM에서 혼합물을 회전시.
자기 스탠드에서 자기 분리를 수행하고 세포 리세이트를 수집합니다. 대상 단백질을 면역글로불린컨쥬게이트 구슬에 결합하려면 구슬을 자기 스탠드에 5분간 놓습니다. 구연산 버퍼를 버리고 셀 리세이트를 구슬에 추가합니다.
50 RPM에서 1 시간 동안 혼합물을 회전합니다. 대상 단백질을 무미 표적 단백질과 분리하려면 1%의 폴리소르바테 20을 함유한 구연산염 완충제 500마이크로리터로 구슬을 세 번 세척한다. 마지막 세척 후, 30 마이크로리터의 구연산 버퍼를 추가하고, 구슬이 실온에서 5분 동안 앉아 대상 단백질을 엘로우하게 한다.
멤브레인을 준비하기 위해 PVDF 멤브레인을 사용하기 직전에 세척한 수술 가위를 사용하여 3mm 단위로 절단하십시오. 멤브레인 조각을 알루미늄 호일에 놓고 각 조각에 2~5마이크로리터를 추가합니다. 멤브레인이 완전히 건조하기 전에 각 조각에 단백질 용출제의 2 ~5 마이크로 리터를 추가하고 멤브레인 표면이 매트 될 때까지 공기 건조.
그런 다음 멤브레인을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에 보관하십시오. 즉시 사용하는 경우 2~30마이크로리터에 탄올을 첨가하여 친수성있게 만듭니다. 파이펫으로 에탄올을 제거하지만 멤브레인이 건조하기 전에 각 튜브에 DTT 기반 반응 용액 200 마이크로리터를 완전히 추가하고 1 시간 동안 섭씨 56도에서 배양하십시오.
인큐베이션 후, 반응 용액을 300마이크로리터의 요오도아세아미드 용액으로 대체하고, 45분 동안 어둠 속에서 배양한다. 그런 다음 증류수로 멤브레인을 두 번 씻고 적어도 10 초 동안 소용돌이하여 2 %의 아세토나이트로 한 번 씻으십하십시오. 다이팔성 관련 아세토닐트리어로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있습니다.
마스크, 안경 및 장갑은 온멤브레인 소화 절차를 수행할 때 항상 착용해야 합니다. 원고 방향에 따라 트립신을 준비하고 각 멤브레인에 트립신 반응 용액 100 마이크로 리터를 추가하십시오. 소화를 위해 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
다음 날, 반응 용액을 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 100 마이크로리터의 세척 용액을 멤브레인에 추가합니다. 멤브레인을 섭씨 60도에서 2시간 동안 배양한 다음 세척 용액을 수집하고 반응 용액과 혼합합니다. 100 마이크로리터의 세척 용액을 멤브레인에 추가하고 10 분 동안 초음파 처리하십시오.
그런 다음 세척 용액을 수집하고 반응 용액과 혼합합니다. 실험실 필름조각으로 테스트 튜브를 덮고 바늘로 필름에 작은 구멍을 만듭니다. 진공 농축기를 사용하여 용액을 건조시키고 잔류물을 2%의 마이크로리터 10마이크로리터로 용해하십시오.
3 분 동안 12, 000 x g에서 튜브를 원심 분리하고 상체관을 샘플 튜브로 옮긴다. 나노 LC/HPLC 시스템에 연결된 질량 분광계를 사용하여 샘플을 분석합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 17개의 단백질은 Calpain-6 관련 면역 절전제에서, 15GFP 관련 면역 절전제에서, 및 11둘 다에서 확인되었다.
후보 단백질의 양성 식별을 위해 적어도 하나의 높은 충실도 펩티드 단편의 검출이 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. GFP 발현 용해뿐만 아니라 히스톤, 외인성 및 리보솜 단백질에 침전된 단백질은 목록에서 생략되었다. 증류수와 2%아세토닐릴로 시도 소화 전에 멤브레인을 세척하는 것은 단백질에 대한 막 소화 절차에서 가장 중요한 단계입니다.
이 방법에 따라, 면역 침전 및 서양 얼룩 분석과 같은 다른 실험을 수행함으로써 표적 단백질의 공동 침전을 확인할 수 있다. 이 간단한 방법은 연구원이 편리하고 고과민한 분석과 새로운 단백질 단백질 상호 작용을 탐구할 수 있게 합니다.
