이 프로토콜은 단일 셀 수준에서 실시간 운동학을 캡처할 수 있습니다. 우리는 HIV 감염에 응하여 개별 세포 매개 변수를 측정하고 바이러스 성 수명 주기의 지연된 단계와 초기 신호 이벤트를 연관시킬 수 있습니다. 이것은 단일 세포 정렬, 배양, 이미징 및 소프트웨어 자동화를 위한 새로운 광유체 플랫폼을 사용하여 전통적인 이미징 방법에 대한 통합 확장 가능한 대안입니다.
이것은 나노 유체, 높은 처리량, 세로 단세포 배양 및 화상 진찰을 위한 첫번째 확립된 방법입니다. 이 기술은 다양한 질병 상태에서 세포 신호 운동 및 동적 분자 상호 작용을 연구하기 위해 광범위하게 채택 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 실험이 설정된 방법, 세포가 펜으로 광학적으로 정렬되는 방법 및 칩을 통해 주입을 설정하는 방법을 전달하는 것이 중요합니다.
우선, 100X 농축 세제 용매 25마이크로리터와 1.000X 플루오-4 AM의 2.5 마이크로리터를 1.5 밀리리터 튜브에 첨가한 다음, 혼합하는 소용돌이를 추가하여 신선한 플루오-4 AM 로딩 솔루션을 준비한다. 배양 매체의 파이펫 2.5 밀리리터가 로딩 솔루션에 넣고 혼합을 반전시다. 원심분리기 2백만 MT-4 셀은 3분 동안 500배 G로, 미디어를 제거하고 준비된 플루오-4 AM 로딩 용액의 2밀리리터에서 펠릿을 재연한다.
파이펫은 35mm 페트리 접시에 세포를 다시 매달아 넣습니다. 섭씨 37도에서 15~30분 동안 배양한 다음 실온에서 15~30분 동안 추가로 배양합니다. 세포 현탁액을 원심분리관으로 옮기고 세포를 500회 G로 3분간 원심분리한 다음 상퍼를 제거합니다.
배양 배지의 1밀리리터와 원심분리기의 1밀리리터로 3분간 세척하여 세포 펠릿을 다시 분리합니다. 적어도 50 마이크로리터에 대한 밀리리터 당 2백만 개의 세포 의 농도에서 배양 배지에서 파이펫팅하여 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 웨트 용액으로 칩을 준비하려면, 젖은 용액의 두 밀리리터와 50 밀리리터의 습윤된 물을 포함하는 원심분리기 튜브를 새로운 광유체 칩으로 기기에 적재하고 습윤 솔루션으로 칩을 범람시키는 습식 칩 기능을 실행합니다.
칩을 섭씨 50도에서 배양하고 칩을 물로 세 번 플러시합니다. 물 플러싱이 완료되면 250 마이크로리터의 문화 매체3사이클로 칩을 플러시하십시오. 칩 채널에 달라붙는 세포의 가능성을 줄이기 위해 로딩 전에 100부 F127 세제 용솔테로 이전 단계에서 세포 현탁액을 보완한다.
계측기 내보내기 바늘을 사용하여 하중 작동과 5 마이크로리터 셀 패키지 부피를 위한 소량 가져오기를 사용하여 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 세포를 가져옵니다. 단일 세포를 자동 감지하고 OEP 케이지로 둘러싸서 근처 펜으로 이동하는 자동 펜 기능을 사용하여 최적화된 광전자 위치 또는 4.3볼트 및 초당 5 마이크로미터의 OEP 전압을 사용하는 펜 셀. 관심 있는 셀이 자동 페닝을 따라 남아 있는 경우 수동 펜 함수를 사용하여 대상 셀과 대상 펜을 선택합니다.
페닝이 완료되면 칩에서 남은 펜닝되지 않은 세포를 지우기 위해 배양 매체의 250 마이크로리터의 3사이클로 칩을 플러시하십시오. 페닝 세포 후, FITC, 텍사스 레드 및 DAPI 채널에서 세포의 형광 이미지를 얻어 기준형 플루오-4, mCherry 및 자동 형광을 측정합니다. 2백만 개의 세포당 13 나노그램의 HIV-1 NLCI 농도로 HIV-1을 마이크로칩에 주입하여 수출 바늘을 통해 칩으로 서스펜션을 천천히 피펫팅합니다.
HIV-1 추가 직후, 10분 의 시간 과정을 통해 FITC 및 DAPI 채널에서 이미지를 반복적으로 얻습니다. 텍사스 레드 및 DAPI 채널에서 1, 2, 3 및 4 일 후에 이미지를 가져옵니다. 이 방법론은 mCherry 측정을 통해 HIV 감염 및 감염되지 않은 세포의 식별 및 클러스터링에 사용되었습니다.
mCherry 신호가 40보다 크거나 낮은 세포, 000평균 형광 강도가 각각 mCherry 고또는 mCherry 저인구로 군집하였다. 이들 클러스터는 9분 동안 플루오-4 형광을 반복적으로 사용하여 세포내 칼슘을 측정하여 칼슘 유입 운동학을 분석하여 HIV 감염 세포에서 초기 칼슘 유입을 입증하였다. 칼슘 유입과 mCherry 꽃의 사이의 상당한 긍정적 인 상관 관계가 관찰되었다.
이 절차를 시도하는 동안, 자란 세포가 이 분석에서 신호의 극적인 감소를 초래할 것이기 때문에 바이러스 생산과 감염 둘 다를 위한 기하급수적인 성장 범위 내의 세포로 시작하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. HIV-1로 작업하는 것은 위험할 수 있습니다. 따라서, OSHA 혈액 매개 병원체 표준에 표시된 바와 같이 BSL-2 관행은 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다.
이 기술은 우리가 통제된 조건의 밑에 단세포 phenotypic 또는 전사 변경을 공부할 수 있기 때문에 흥미롭습니다. 이것은 많은 세포 모형에 있는 분자 통로에 자극의 충격을 상관관계를 위한 광범위한 잠재력을 가지고 있습니다.
