HIV - 1 에이 킨 실험실에서 uncoating 연구는 NIH 보조금 AI40364, AI50423 및 AI076121 지원했다. p24 엘리사에 사용되는 시약을 포함한 몇 가지 주요 자료, NIH AIDS 연구 및 레퍼런스 프로그램, 에이즈 학부, NIAID, NIH에 의해 제공되었다.

1. HIV - 1 입자의 제작 진행하기 전에 허가를 받아야하고 감염 HIV에 대한 승인 biosafety 시설에서 작업에 기관의 Biosafety 사무실에서 지침을 따르십시오. 그 적절한 치료를 보장해야하며, 안전 조치가 biosafety 연구실에 근무하는 동안 따라하고 있습니다. HIV - 1 입자의 생산은 일반적으로 칼슘 인산염 transfection 방법 7, 8을 사용하여 HIV - 1 proviral DNA로 293T 세포의 과도 transfection에 의해 수행됩니다. 감염된 T 세포의 문화로 성장 높은 titer의 바이러스 주식도 적합합니다. <ol><li> 10% 태아 소 혈청 (FBS)과 항생제로 보충을 포함하는 Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 문화 293T 세포 [페니실린 (100 IU / ML) 및 스트렙토 마이신 (100 μg / ML)] 37 ° C, 5 % CO 2에서 . </li><li> 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 종자 2x10 6을 사용 거의 합류 요리에서 세포를 분리 </stransfection하기 전에 최대 100mm 문화 요리 당 9 ML에서&gt; 세포 하루. virions의 생산을위한 종자 여섯 100mm 문화 요리. 코어의 집중 준비가 필요한 경우 더 많은 요리는 transfection을 위해 씨앗을 수 있습니다. </li><li> 다음날, 세포 monolayers이 25 % 정도 합류하여 transfection 준비되어야합니다. transfected 수 세포 여섯 요리, 멸균 물 2.7 ML의 볼륨 proviral DNA 120 μg을 가져 오십시오. 이 혼합물 2.5 M CaCl 2 0.3 ML과 2XBBS 3 ML을 추가하고 몇 시간을 아래와 pipetting하여 적절히 섞는다. 혼합물이 10~20분 위해 상온에서 대기하도록 허용합니다. </li><li> 섞어 부드럽게 소용돌이 치는 동안 각 요리의 중심에 결과 혼합 dropwise 1 ML을 추가합니다. 35 ° C 3 % CO 2 배양기 세트에 밤새 요리를 (~ 16 시간) 장소. </li><li> 문화 매체를 대기음 부드럽게 5 ML PBS를 추가합니다. </li><li> PBS를 대기음 신선한 매체의 5 ML를 추가합니다. 37 AT &amp; 보육 문화의 세포있길, C와 5 % 추가 24~48시간 2를 CO. </li><li> 바이러스 입자를 포함하는 문화 뜨는를 수집, 50 ML 원추형 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 모든 요리에서 supernatants를 결합하고 펠릿 세포와 찌꺼기로 5 분 1,500 XG에 원심 분리기. 0.45 μm의 기공 크기의 주사기 필터를 사용하여 표면에 뜨는을 필터링합니다. 주의 사항은 라이브 바이러스에 작업하는 동안 에어로졸 형성을 최소화하기 위해 이동해야합니다. 이것은 원심 분리의 단계에서 O - 링 또는 로터 버킷 커버와 원뿔 튜브의 사용을 포함하고 있습니다. 이것이 가능하지 않으면, 튜브의 나사 뚜껑은 parafilm로 포장되어야합니다. </li></ol> 2. ultracentrifugation에 의해 HIV - 1 virions의 농도 <ol><li> 38.5 ML의 polyallomer의 원심 분리기 튜브 (베크 만 SW32Ti의 회전자 또는 이와 동등한 해당)의 문화 뜨는 (30 ML)를 놓습니다. 부드럽게 5 ML의 pipet을 사용하여 PBS에 20 %의 자당 5 ML 솔루션으로 바이러스가 포함된 뜨는을 밑받침. </li><li> 3 시간 동안 원심 분리기4 32,000 RPM ° C (R 최대시 175,000 XG) 펠릿 바이러스 입자 수 있습니다. </li><li> 튜브의 하단에있는 펠렛을 방해하지 않도록 돌봐, 흡인에 의해 뜨는 제거합니다. 4 관과 장소에 1XSTE 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL [산도 7.4], 100 MM NaCl, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎜)의 0.5 ML 추가 ° C 1 시간 동안 펠렛을 느슨하게합니다. 부드럽게 pipet 위아래로 몇 번 튜브의 바닥에서 펠릿를 분리하는 넓은 구멍 하나 ML의 pipet 팁을 사용합니다. 다음 거품 피하기 위해 간병, 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 느슨하게 펠렛을 전송. 바이러스의 작은 대단히 짧은 시간이 해산 수 있도록 다른 1~3시간 4 ° C에서 품어. 이 기간 동안, 같은 단계 3.1에서 설명한 자당 기울기를 준비합니다. </li><li> 부드럽게 pipet 바이러스 정지 위아래로 4 8000 RPM (6,000 XG) ° C 1 분에 대한 냉장 microfuge시 몇 시간 및 원심 분리기는 잔류 대단히 짧은 시간을 제거합니다. 이 과정에서 샘플 추위 보관하십시오. </li></ol> 3. 자당 기울기코어를 분리하기 위해 원심 분리 HIV - 1 코어는 HIV - 2 코어 10 정화를 위해 이전에 설명한 방법의 수정입니다 &quot;스핀 - thru&quot;방법 9를 사용 고립됩니다. <ol><li> SW32.1Ti 회전자의 14.5 ML의 polyallomer의 원심 분리기 튜브의 1XSTE 버퍼에 12 ML 리니어 30% 70 % 자당 기울기를 준비합니다. 경사도를 준비하려면, 전 20 ML 기울기를 사용하여, 장소 가까운쪽에 70 % 자당 용액 6 ML (가까운 콘센트 포트)과 반대편에있는 30 % 자당 용액 6 ML합니다. 공기 방울이 두 방을 연결하는 채널에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 바닥에서 하단에있는 85 % 자당 용액 1 ML이 들어있는 튜브의 상단에 그라디언트를 펌프로 전 자동 Densi 흐름 구배를 사용합니다. 부드럽게 4 그라디언트를 배치 ° C까지 냉각 (2-4시간). </li><li> 넓은 구멍 하나 ML의 pipet 팁을 사용하면 부드럽게 1퍼센트 트리톤 X - 100을 포함하는 STE의 15 % 자당 용액의 0.25 ML로 그라데이션을 오버레이. </리&gt; <li> 넓은 구멍 하나 ML의 pipet 팁을 사용하는 STE에서 7.5 % 자당 용액의 0.25 ML로 부드럽게 오버레이. 레이어를 혼합하지 않도록주의하십시오. </li><li> 2.4 단계에서 0.5 ML 바이러스 서스펜션과 함께 부드럽게 오버레이. 이 단계는 모든 그라디언트의 방해와 underlaid 자당 레이어의 혼합을 피하기 위해주의 깊게 수행해야합니다. </li><li> 4 박 32,000 RPM (R 최대시 187,000 XG) (16~20시간)의 사전 냉각 SW32.1Ti 양동이와 원심 분리기 ° C.에 튜브를 삽입 원심의 진공이 250 μm의에 도달할 때까지 원심의 일시 중지되지 않도록하려면 원심 분리를 시작하지 </li><li> 상단에서 자동 Densi 흐름 기울기 fractionator를 사용하여 그라디언트의 하단에 1 ML 분수를 수집합니다. 수령 즉시 얼음에 튜브를 삽입합니다. 반전 몇 배 튜브의 내용을 믹스하고, 엘리사 또는 역방향 transcriptase 활동 분석에 의해 부량 각 분획의 50 μl를 철회. </li></ol> 4. HIV - 1 코어의 현지화그리고 코어의 저장 용량 <ol><li> uncoating assays를 수행하기 전에, 그것은 분수가 그대로 HIV - 1 코어를 포함하고 결정하는 것이 중요합니다. 이것은 p24 엘리사 또는 단계 3.6에서 50 μl aliquots를 사용하여 역방향 transcriptase 활동 분석에 의해 결정하실 수 있습니다. </li><li> 코어와 관련된 CA의 복구는 종종 코어의 안정성 관련이 있습니다. p24 엘리사 9 각 분획에서 샘플을 사용하여 코어 관련된 CA를 측정. 또한, 각 분획의 리버스 transcriptase 활동을 측정합니다. 두 가지 방법을 사용하여 정상이 분수 약 10하여야한다. </li><li> 코어를 포함하는 분수 수영장. 코어는 0.2-0.3 ML의 aliquots, -80에서 액체 N2와 저장소에 플래시 동결 ° C.에 풀링된 코어 즉시 나누어지는를 분석을 uncoating 사용할 수없는 경우 이러한 방식으로 냉동 코어 uncoating 분석에 적합합니다. 코어 관련된 CA의 수확량은 일반적으로 p24 당 밀리리터 1-2 μg 또는 전체 virion - 관련의 약 15 %입니다p24. </li></ol> 5. HIV - 1 uncoating의 운동 분석 <ol><li> uncoating 반응 당 필요한 HIV - 1 코어의 양은 약 50 NG입니다. 시험 관내 uncoating 분석에서 수행하려면 정지의 점도를 줄이기 위해 추운 1XSTE 버퍼의 동일한 볼륨 코어의 나누어지는을 predilute하고 pipetting 오류를 최소화하기 위해. </li><li> 또한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에서 10 μg / BSA의 ML을 포함하는 차가운 1XSTE 버퍼의 0.15 ML로 코어 100 μl를 희석. 우리는 튜브 벽에 CA의 흡착을 최소화하기 위해 BSA (10 μg / ML)와 STE 버퍼를 보충. 반전 튜브를 여러 번하여 섞는다. 샘플 와동하지 마십시오. 37 물 목욕에 튜브를 품어 ° C 시간 초과 간격에 대한 (15, 30, 60 및 120 분). 튜브도 온난화을 보장하기 위해서는 적어도 최대 내부 샘플의 수준에 물 목욕에 열중한다. </li><li> - 부화하는 동안 부드럽게 (보통 5 주기적으로 튜브의 내용을 혼합튜브를 flicking 10 분). 제로 분 컨트롤에 대한, 추운 1XSTE 버퍼의 0.15 ML로 코어 100 μl를 희석하고 실험 (120 분)의 전체 길이 얼음 알을 품다. 제로 분 컨트롤은 기초 uncoating 가치를 제공하고 다른 ° C 시간 초과 간격을 위해 37 incubated 코어 uncoating 증가를 결정하는 데 사용됩니다. </li><li> 부화 기간의 끝에, 10 분 동안 얼음에 튜브를 삽입하여 uncoating 프로세스를 중지합니다. </li><li> 45,000 RPM (TLA - 55 로터, R 최대시 125,000 XG)에서 튜브를 원심 4 20 분 ° C. 이것은 펠렛 코어 uncoating의 결과로 발표 그대로 코어와 무료 CA는 뜨는에 남아있는 것이다. 로터는 ° C 전에 샘플을 로딩하기 위해 4 precooled해야합니다. </li><li> 가급적 상온에서 저장 겔 로딩 팁을 사용하여 새 precooled microfuge 튜브에 뜨는을 전송합니다. 펠렛은 육안으로 볼 수 없다는 점에 유의하시기 바랍니다, 그래서 극단주의 w를뜨는을 pipetting hile. 엘리사 샘플 희석제 250 μl (PBS에 0.​​5 % 트리톤 X - 100과 5% 기증자 송아지 혈청)에 알약을 Resuspend. 엘리사 샘플 희석제를 추가한 후 펠렛의 효율적인 해산, 소용돌이를 보장합니다. 는 다음 섹션에서 설명 p24 엘리사를 사용하여 펠렛과 뜨는의 CA 내용을 계량. </li><li> uncoating의 범위는 뜨는에있는 CA의 분수를 계산하여 얻을 수 있습니다. </li></ol> 6. p24 엘리사에 의해 CA에 대한 분석 <ol><li> 많은 상업 엘리사 키트는 가능하며 CA를 계량하는 데 사용할 수 있습니다. 상업적 또는 &quot;사내&quot;엘리사를 사용하여 분석의 선형을 결정하는 p24 기준을 포함​​합니다. 샘플 Dilutions는 정확성을 보장하기 위해 assayed해야합니다. </li><li> 우리는 정기적으로 CA에 대해 분석하는 데 사용하는 수제 엘리사를 개발했습니다. 절차는 이전 보고서 11 적응하고 NIH 보조에서 제공 캡처 및 검출기 항체를 사용하여 수행됩니다S 연구 및 참조 시약 프로그램. </li></ol> 7. 대표 결과 : 코어를 포함한 분수를 결정하기위한 엘리사에서 결과의 예제는 그림 1에 표시됩니다. 분수 (1 ML 각)를 수집 후, 각 분획의 시료 50 μl는 시리얼 dilutions를 만들기 위해 사용되었으며 엘리사에 의해 분석. 열두 분수에 대한 값을 추가하여 얻은 총 p24는 14.5 μg되었습니다. 다른 이름으로 그림 분수에서 8-10 포함된 코어를 표시했습니다. 코어가 포함된 분수에 대한 p24 가치는 2.17 μg되었습니다. 코어 연관된 p24의 비율 (14.97 %)가 전체 p24 값 (14.5 μg)에 핵심 분수에 대한 p24 가치의 비율 (2.17 μg)을 복용에 의해 결정되었다. 분수 1 또는 2는 항상 p24의 최고 금액을 포함합니다, 이것은 코어와 관련되지 않습니다 무료로 CA를 나타냅니다. 이것은 이후의 각 분수와 p24 가치의 점진적 감소, 그리고 날카로운 증가와 p24의 마지막 날카로운 드롭을 따라값. 그라데이션을로드하는 동안 적절한 치료가 함락되는 순간면 코어 관련된 CA의 정상은 약 10 분수 발견된다. HIV - 1 코어 uncoating의 속도론을 시금 얻은 전형적인 결과는 그림 2에 표시됩니다. 그래프는 야생 형 HIV - 1 코어 uncoating에서 시간 의존 증가를 보여줍니다. 가치를 uncoating %가 뜨는에있는 CA의 분수를 계산하여 얻은 것입니다. 연습, 분석은 높은 재현성하고 체외에서 바이러스 코어의 안정성을 결정하는 데 유용합니다. 분석의 재현성이 절차를 수행하는 동안 샘플의 적절한 취급에 크게 의존된다는 점에 유의하시기 바랍니다. 코어 더위 불안 정한 있으므로 샘플은 ° C의 분석을 통해 잠복기 동안을 제외한 4 유지되어야합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" /> 1 평형 밀도 구배 원심 분리의 그림HIV - 1 코어. 집중 바이러스 정지 1% 트리톤 - X - 100과 함께 겹쳐 30~70% 선형 자당 기울기의 상단에 적용되었습니다. 187,000 XG와 4 박 원심 분리를 다음 ° C, 1 ML의 분수가 아래로 위로 (분수 1) (분수 12)에서 수집되었고 p24은 엘리사에 의해 계량했다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" /> 체외에서 HIV - 1 uncoating 2 시간 코스를 그림. 정화 HIV - 1 코어가 ° C 지정된 시간 간격에 대한 희석하고 37 incubated했다. 제로 분 샘플은 실험의 전체 길이 얼음 incubated되었습니다. 부화 후, 샘플 4 ° C.에 20 분 동안 125,000 XG에 ultracentrifuged되었습니다 뜨는와 알약은 p24 엘리사로 구분하여 분석했다. 프로토콜 텍스트에서 설명한대로 uncoating의 범위가 결정되었습니다. 각 uncoating 반응은 중복으로 수행되었다; 오차 막대는 두 값의 범위를 스팬.

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 메서드는 대상 세포에서 HIV - 1 uncoating을 분석 검증 방법 unavailability 특히 인해 HIV - 1 수명주기의이 단계를 공부하는 데 유용합니다 체외에서 uncoating 공부 HIV - 1 코어를 정화하려면 여기를 설명했다. 이 방법은 코어를 정화 평형 ultracentrifugation를 사용하지만, 다른 사람들이 한때 용해 후 직접 pelleting를 사용한 1퍼센트 트리톤 - X - 100 12, 13 또는 0.1 % 트리톤 - X - 100 14, 15 겹쳐 자당...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> 시약의 이름 </td><td width="197"> 회사 </td><td width="114"> 카탈로그 번호 </td><td width="161"> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 - X - 100 </td><td> Mallinckrodt 베이커 Inc의 </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Cellgro </td><td> 25-053 - CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> 구성 : 50mM BES [P H 6.95], 280 MM NaCl 및 1.5 MM 나 2 HPO 4. 6.95로 산도를 조정상온에서. 소독 및 -20 ° C.에 aliquots에 저장을 필터 </td></tr><tr><td> 코팅 항체 : p24에 단클론 항체 (183 - H12 - 5C) </td><td> NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> 차 항체 : HIV - IG (hyperimmune 인간 환자의 혈청) </td><td> NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> 차 항체 : 염소 안티 인간 IgG, 복합 퍼옥시데이즈 </td><td> 찌르다 </td><td> 31,130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP 기판 </td><td> KPL Inc의 </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96 잘 접시 </td><td> 써모 과학 </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti 및 SW32.1 티의 로터와 호환 초원 심 분리기 </td> &lt;TD&gt; 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA - 55 로터와 탁상 초원 심 분리기 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 고속 microfuge 튜브 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> 자동 Densi 흐름 밀도 구배 fractionator </td><td> Labconco 주식 회사 </td><td> 4,517,000 </td><td></td></tr><tr><td> 그라데이션 구 </td><td> CBS 과학 주식 회사 주식 회사 </td><td> GM - 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

retroviruses의 게놈은 지질 봉투에 둘러싸인 capsid으로 쌌다는 것입니다. 이러한 HIV - 1과 같은 lentiviruses, 들어, 원뿔 capsid의 껍질은 육각의 격자로 배열 CA 단백질로 구성되어 있습니다. capsid는 원추 1, 2의 좁은 끝에 7 광범 끝에 pentamers와 5 닫힙니다. 이 capsid의 쉘으로 쌌다는 바이러스 ribonucleoprotein 복합이며, 함께 그들은 코어를 구성. 대상 세포막과 바이러스 세포막의 융합에 따라, HIV - 1은 세포질에 발표됩니다. capsid 다음 uncoating이라고도 과정에서 용해 형태로 3 무료 CA를 방출 disassembles. HIV - 1 uncoating의 세포내 위치와 타이밍을 제대로 이해하고 있습니다. capsid의 안정성을 변경 CA에서 단일 아미노 산 대체는 또한 세포 4 감염 HIV - 1의 능력을 손상. 이것은 capsid의 안정성은 HIV - 1 감염에 대해 중요한 것을 나타냅니다. </p&gt; HIV - 1 uncoating이 프로세스에 대한 민감하고 안정적​​인 assays의 가용성의 부족으로 인해 공부를 어렵게되었습니다. 여기 감염 HIV - 1 입자로부터 분리된 코어를 사용하여 체외에서 uncoating 공부를위한 양적 방법을 설명합니다. 접근 방식은 추위에 세제의 계층 통해 선형 자당 기울기에 집중 virions의 침강에 의해 코어의 고립을 포함한다. uncoating 계량하려면, 분리된 코어는 37 incubated 아르 ° C 각종 초과 간격 및 ultracentrifugation에 의해 연속적으로 pelleted하십시오. uncoating의 범위가 뜨는에서 CA의 분율을 quantifying 의해 분석됩니다. 이 접근은 HIV - 1 capsid 안정성 4, 5, 6에서 바이러스 변이의 효과를 분석하기 위해 고용되었습니다. 또한 HIV - 1 uncoating의 세포 요소의 역할을 공부하는 데 유용합니다.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating는 HIV - 1 수명주기의 초기 단계에 필수적인 단계이며 capsid 쉘의 해체와 바이러스 ribonucleoprotein 복합 (vRNP)의 출시로 정의됩니다. 여기, 우리는 HIV - 1 virions에서 그대로 코어를 분리 및 그들의 uncoating을 quantifying 기술을 입증<em&gt; 체외에서</em&gt;.

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

15.6K 조회수.  Vanderbilt University School of Medicine. Uncoating는 HIV - 1 수명주기의 초기 단계에 필수적인 단계이며 capsid 쉘의 해체와 바이러스 ribonucleoprotein 복합 (vRNP)의 출시로 정의됩니다. 여기, 우리는 HIV - 1 virions에서 그대로 코어를 분리 및 그들의 uncoating을 quantifying 기술을 입증 체외에서.

비디오: In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

연구

면역학 및 감염병학

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Genotypic 접근 방법을 사용하여 시퀀스 분석에 의한 HIV-1 Coreceptor 사용 (Tropism)의 예측

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해<em&gt; 시험관</em&gt; HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 Phagosome 마이그레이션 및 속도

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

측정<em&gt; 체외</em&gt; HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...