단백질의 기능은 온도에 따라 다르며 온도에서 최적입니다. 이 프로토콜은 더 높은 온도에서 단백질 구조를 해결하는 방법을 제공합니다. 이 접근법은 기능적으로 관련된 구조를 제공하고 단백질 구조의 온도 의존성에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 Academia Sinica Cryo EM 시설의 관리자 인 Yuan-Chih Chang입니다. 닫힌 끝의 50mm 원심 분리기 튜브에 1cm 구멍을 만드는 것으로 시작하십시오. 초음파 물 출구에서 유리화 장치 약실에 있는 관을 두십시오.
유리화 장치 온도를 지정된 온도로 설정하고 유리화 장치 챔버가 섭씨 55도 및 100% 상대 습도에 도달하도록 합니다. 실험을 시작하기 전에 조건을 안정화하기 위해 적어도 30 분 동안 그대로 두십시오. 수조를 핫 플레이트에 놓고 핫 플레이트를 원하는 온도로 설정합니다.
온도계로 물이 섭씨 55도에 도달하는지 확인하십시오. 샘플을 수조에서 배양하고, 블로팅 실험 전에 핫플레이트의 가장자리에 있는 피펫 팁을 2분 이상 예열한다. 글로우는 구멍이 많은 탄소 지지 그리드를 25밀리암페어에서 30초 동안 방전합니다.
유리화 여과지를 블로팅 실험 5분 이내에 유리화 장치 챔버에 넣습니다. 유리화 장치에서 그리드와 함께 핀셋을 2 분 이상 배양하십시오. 표준 절차에 따라 에탄으로 에탄 용기를 구축하여 에탄이 넘치지 않도록하십시오.
피펫을 사용하여 7-9 마이크로 리터의 샘플을 그리드에 적용하십시오. 다음 1 2 초 동안 기다렸다가, 1 초에서 1 및 30 초 동안 얼룩을 뽑고, 액체 에탄으로 표본을 빨리 던지십시오. 액체 에탄에서 액체 질소에 저장된 냉동 상자로 그리드를 옮깁니다.
그리드를 클립하고 언로드하여 전자 현미경 또는 Cryo EM 기기를 획득합니다. Cryo EM 기기의 디스플레이 화면과 소프트웨어의 저선량 기능을 사용하여 그리드의 얼음 상태와 그리드의 샘플 분포를 스크리닝합니다. 결과 그리드의 품질이 좋지 않으면 대기 시간, 블로팅 시간 등과 같은 다양한 조건으로 그리드 준비 과정을 반복하십시오.
결과 그리드의 품질이 좋으면 동일한 단계를 반복하여 다른 온도에서 그리드를 만듭니다. 양질의 그리드를 고해상도 Cryo EM 기기로 전송합니다. 확립된 절차에 따라 데이터 수집 및 데이터 분석을 수행합니다.
성공적인 그리드의 경우, 그리드의 왼쪽 상단에 더 두꺼운 얼음과 오른쪽 하단에 더 얇은 얼음으로 얼음 그라데이션이 형성되었습니다. 데이터 수집에 적합한 파란색 및 녹색 상자가 성공적인 그리드에서 관찰되었습니다. 다른 그리드에서 밝은 대비가 관찰되었습니다.
얇은 층, 얼음 또는 얼음이 없음을 나타냅니다. 두 번째 그리드에서 데이터 수집에 적합한 것으로 확인된 사각형은 두 개뿐입니다. 그리드 중 하나는 대부분 결정질 형태의 얼음으로 구성되어 데이터 수집에 적합하지 않았습니다.
반면에, 다른 그리드는 얼음층이 대부분 데이터 수집에 적합한 무정형 상태임을 보여주었다. 용기 및 기타의 준비는 시점에 따라 완료되어야합니다. 시간 제어와 실험을 빠르고 정확하게 완료하는 것이 가장 중요합니다.
이 프로토콜을 사용하여 얻은 결과에 따라 연구원은 간단한 조건을 설정하는 데 더 주의해야 할 수도 있습니다.
