단일 입자 냉동 전자 현미경 검사는 원자 분해능에 가까운 거대 분자의 구조화 된 결정을위한 방법입니다. 이미지 처리 및 구조 계산에 여러 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있지만 3D 맵의 결과는 계산 중에 적용되는 알고리즘의 차이로 인해 품질과 해상도가 달라지는 경우가 많습니다. 따라서, 상이한 프로그램들의 조합을 사용하는 것은 종종 최적의 결과를 달성하는 데 유익하다.
이 프로토콜은 사용자가 CryoSPARC, RELION 및 Scipion의 세 가지 cryo-EM 처리 플랫폼에서 워크플로를 탐색하도록 안내합니다. 우리는이 파이프 라인을 사용하여 유전자 치료에 널리 사용되는 벡터 인 아데노 관련 바이러스의 고해상도 구조를 얻는 방법을 시연 할 것입니다. 웹 브라우저에서 CryoSPARC v3을 열고 프로젝트의 작업 영역을 만든 후 새 작업 영역으로 이동하여 오른쪽 패널에서 작업 작성기를 엽니다.
동영상 가져 오기를 클릭하고 동영상 경로를 제공하고 참조 파일 경로를 얻으십시오. 그런 다음 획득 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 대기열을 클릭하고 작업 영역과 작업 공간을 실행할 차선을 선택하고 생성을 클릭하십시오.
패치 동작 수정 및 가져오기 동영상 작업 카드를 엽니다. 그런 다음 imported_movies 출력을 새 작업의 동영상 자리 표시자로 드래그하고 작업을 대기열에 넣습니다. 콘트라스트 전달 기능 또는 CTF 추정을 수행하려면 패치 CTF 추정을 엽니다.
생성된 현미경 사진을 입력하고 작업을 큐에 넣습니다. 평균 및 CTF 보정된 현미경 사진을 검사하고 추가 처리를 위한 하위 집합을 선택하려면 큐레이트 노출을 열고 이전 단계에서 얻은 노출을 입력하고 작업을 큐에 넣습니다. 작업이 대기 모드로 전환되면 작업 카드의 대화식 탭을 클릭합니다.
파라미터 임계값을 조정하고 추가 처리를 위해 개별 현미경 사진을 수락하거나 거부합니다. 현재 데이터를 처리하는 동안 난시의 상한치를 400 옹스트롬으로 설정하고, CTF 적합 분해능을 다섯 옹스트롬으로, 상대 얼음 두께를 두 개로 설정하십시오. 그런 다음 완료를 클릭하여 다운스트림 처리를위한 현미경 사진을 선택하십시오.
수동 기반 선택의 경우 수동 선택기를 엽니다. 허용된 노출을 입력하고 작업을 큐에 넣습니다. 그런 다음 대화 형 탭을 클릭하고 상자 크기를 300 픽셀로 설정 한 다음 여러 현미경 사진에서 수백 개의 입자를 클릭하여 겹치는 입자를 피하십시오.
선택이 끝나면 추출 입자 선택 완료를 클릭하십시오. 다음으로, 자동화된 입자 채취를 위한 템플릿을 생성하려면 2D 분류를 클릭하고 생성된 파티클 픽을 입력합니다. 그런 다음 2D 클래스 수를 10으로 변경하고 작업을 큐에 넣습니다.
그런 다음 선택 2D 클래스를 열고 이전 단계에서 얻은 파티클 및 클래스 평균을 입력합니다. 그런 다음 대화 형 탭을 클릭하고 신호 대 잡음비가 좋은 대표적인 2D 클래스를 선택하고 완료를 클릭하십시오. 템플릿 기반 파티클 피킹의 경우 템플릿 선택기를 열고 선택한 2D 클래스 및 현미경 사진을 입력합니다.
그런 다음 입자 직경을 220 옹스트롬으로 설정하고 작업을 대기열에 넣습니다. 마지막으로, 현미경 사진에서 추출을 열고 입자 선택을 검사하여 얻은 현미경 사진 및 입자를 입력하십시오. 그런 다음 추출된 상자 크기를 300픽셀로 설정하고 작업을 큐에 넣습니다.
2D 분류의 경우 2D 분류를 클릭하고 추출된 입자를 입력합니다. 그런 다음 2D 클래스 수를 50으로 설정하고 작업을 큐에 넣습니다. 그런 다음 선택 2D 클래스를 열고 얻은 파티클과 클래스 평균을 입력하십시오.
대화식 탭을 클릭합니다. 해상도와 클래스의 입자 수에 따라 2D 클래스를 선택하고 완료를 클릭하십시오. 초기 3D 볼륨을 생성하려면 ab-initio 재구성을 열고 최종 2D 분류에서 파티클을 입력합니다.
그런 다음 대칭을 icosahedral로 조정하고 작업을 대기열에 넣습니다. 다음으로, 균질 정제를 열고, 이전 단계로부터의 부피와 최종 2D 분류로부터의 입자를 입력한다. 그런 다음 대칭을 변경하고 작업을 큐에 넣습니다.
작업이 완료되면 푸리에 쉘 상관 관계 또는 FSC 곡선을 검사하고 볼륨을 다운로드하여 UCSF 키메라에서 검사합니다. CryoSPARC v3에서 최종 2D 분류에서 선택한 2D 클래스 작업의 작업 카드를 엽니다. 그런 다음 세부 정보 탭에서 내보내기 작업을 클릭하십시오.
PyEM을 사용하여 particles_exported를 변환하십시오. cs 파일을 표시된 명령을 실행하여 별표 형식으로 지정합니다. 입자 추출을 클릭 한 후 I / O 탭에서 CTF 보정 된 현미경 사진 및 좌표를 입력하십시오.
그런 다음 추출 탭을 클릭하고 입자 상자 크기를 300 픽셀로 변경하고 작업을 실행하십시오. 3D 구체화를 위해 CryoSPARC v3에서 생성된 맵을 RELION-3의 초기 모델로 사용합니다. 가져오기 방법을 선택하고 I/O 탭에서 표시된 매개 변수를 설정합니다.
그런 다음 다른 탭에서 CryoSPARC v3 맵을 입력 파일로 선택하고 노드 유형을 3D 참조로 변경하고 작업을 실행합니다. 그런 다음 3D 자동 구체화를 선택하고 I/O 탭에서 입력 이미지를 파티클로 설정합니다. 마지막 선택 작업의 별 파일
CryoSPARC v3 재구성을 참조 맵으로 사용하고 참조 탭을 클릭하고 초기 저역 통과 필터를 50 옹스트롬으로 변경하고 대칭을 icosahedral으로 변경하십시오. 그런 다음 최적화 탭에서 마스크 직경을 280 옹스트롬으로 변경하고 작업을 실행하십시오. 사후 처리를 위해 사후 처리를 클릭하십시오.
그리고 I/O 탭에서 생성된 절반 맵과 마스크를 입력하고 보정된 픽셀 크기를 1.045 옹스트롬으로 설정합니다. 그런 다음 선명하게 탭에서 B 계수를 자동으로 추정하려면 yes를 입력하십시오. 자동 B 피팅의 최저 해상도의 경우 10을 입력합니다.
그리고 자신의 B 팩터를 사용하려면 no를 입력하십시오. 마지막으로 필터 탭에서 FSC 가중치 건너뛰기를 no로 설정하고 작업을 실행합니다. 연마 훈련을 위해서는 베이지안 연마를 엽니 다.
I/O 탭에 모션 보정된 현미경 사진, 파티클 및 포스트프로세스를 입력합니다. 이전에 얻은 별 파일. 학습 탭을 클릭하고 테스트를 위한 푸리에 픽셀의 일부인 예(yes)로 최적의 매개 변수를 설정하고, 이 많은 파티클을 5, 000으로 사용합니다.
그런 다음 작업을 실행합니다. 교육 작업이 완료되면 베이지안 연마를 클릭하십시오. 그런 다음 학습 탭에서 학습 최적 매개 변수를 no로 설정합니다.
폴란드어 탭을 선택하고 최적화된 매개변수 파일에서 opt_params_all_groups의 경로를 지정합니다. 이전 단계의 txt 파일을 클릭하고 실행을 클릭하십시오. 더 높은 차수 수차를 추정하려면 CTF 구체화를 엽니다.
파티클 아래의 I/O 탭에서 최근에 정제된 3D 작업에서 연마된 파티클이 포함된 스타 파일의 경로를 선택합니다. 그런 다음 사후 처리 STAR 파일에서 최신 후처리 작업의 출력 경로를 설정합니다. 그런 다음 적합 탭을 선택하고 추정 이방성 배율을 no로 설정합니다.
CTF 매개변수 피팅을 no로 수행합니다. 빔틸트를 예로 추정합니다. 또한 trefoil을 yes로 추정하십시오.
그리고 네 번째 순서 수차를 예로 추정하십시오. 그런 다음 작업을 실행합니다. RELION-3 맵을 더욱 구체화하고 검증하려면 Scipion 3을 시작하고 새 프로젝트를 만듭니다.
왼쪽 프로토콜 패널에서 가져오기 드롭다운을 선택하고 가져오기 파티클을 클릭합니다. 매개 변수 가져오기를 RELION-3으로 변경하고 별 파일을 postprocess.star로 변경합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 획득 매개 변수를 지정하고 실행을 클릭합니다.
그런 다음 가져 오기 드롭 다운을 클릭하고 가져 오기 볼륨을 선택하십시오. 가져오기에서 RELION-3 맵에 대한 경로를 지정하고 픽셀 크기 샘플링 속도를 픽셀당 1.045 옹스트롬으로 변경하고 실행합니다. 전역 정렬을 수행하려면 프로토콜 패널에서 세분화 드롭다운 메뉴를 선택하고 xmipp3-highres를 클릭합니다.
이전 단계에서 가져온 파티클과 볼륨을 각각 전체 크기 이미지와 초기 볼륨으로 입력하고 대칭 그룹을 icosahedral으로 설정합니다. 그런 다음 각도 할당 아래의 이미지 정렬 탭에서 전역을 선택하고 최대 대상 해상도를 세 개의 옹스트롬으로 설정하고 작업을 실행합니다. 로컬 정렬을 수행하려면 xmipp3-highres 전역을 선택하고 이전 실행에서 계속을 예로 변경하고 이전 작업을 선택합니다.
그런 다음 각도 할당 탭에서 이미지 정렬을 로컬로 변경하고 최대 대상 해상도를 2.1 옹스트롬으로 설정합니다. 완료 후 xmipp3 고해상도 결과 창에서 디스플레이 해상도 플롯을 클릭하여 구체화 후 FSC가 어떻게 변경되었는지 확인하고 각도가 변경된 플롯 히스토그램을 클릭하여 오일러 각도 할당이 변경되었는지 확인합니다. UCSF 키메라의 볼륨을 검사합니다.
확대하여 고해상도 기능을 찾습니다. 좋은 CTF 적합성과 낮은 난시를 가진 현미경 사진은 추가 처리를 위해 선택되었으며, 난시와 몰수가 높은 현미경 사진은 폐기되었습니다. 잘 정의된 클래스를 포함하는 2D 클래스 평균이 선택되었고, 분해능, 잡음 및 부분 파티클이 낮은 클래스가 있는 클래스가 거부되었습니다.
아데노-관련 바이러스의 원자 좌표가 장착된 냉동 전자 현미경 지도의 영역이 여기에 도시되어 있다. 잘 정의 된 EM 밀도는 개별 아미노산, 물 분자 및 마그네슘 이온의 측쇄를 피팅 할 수 있습니다. CryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion을 사용하여 계산된 FSC 곡선은 워크플로우 전반에서 해상도가 증가함을 나타내며, 구조 및 해상도 히스토그램을 통해 네 개의 서로 다른 슬라이스에서의 해상도 추정치는 워크플로우 전체에서 맵 간의 로컬 해상도가 점진적으로 향상되었음을 보여줍니다.
CryoSPARC, RELION-3, Scipion 및 Phoenix의 cryo-EM 처리 알고리즘을 결합하면 처리 파이프 라인에서 아데노 관련 바이러스 구조의 해상도가 2.9에서 2.3 옹스트롬으로 증가했습니다. 각 단계에 지정된 매개 변수는 샘플 및 현미경에 따라 다르다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 고해상도에 도달하는 능력은 샘플 및 원시 데이터의 품질에 따라 크게 달라집니다.
이 비디오에서는 다양한 소프트웨어 플랫폼에서 cryo-EM 데이터를 처리하기 위한 강력한 SP 워크플로우를 제시합니다. 이 방법을 사용하면 여러 프로그램에 대한 알고리즘을 구현하여 냉동 구조를 개선하고 검증 할 수 있습니다. 이 워크플로우는 다양한 거대분자 어셈블리의 구조 계산에 적용할 수 있습니다.
