Name: sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
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R.B.는 Searle 학자 프로그램, 트 면 스미스 재단 (C1404), 그리고 천 재단 (1-년도-15-344)의 3 월에 의해 지원 되었다. B.A.G는 NIH에서 지원 R01GM110174 및 NIH R01AI118891 국방부 뿐만 아니라 BC123187P1를 부여 부여 인정 합니다. R.W.-T. NIH 훈련 그랜트 T32GM008216에 의해 지원 되었다.

1. 문화 및 mESCs의 확장 참고: 마우스 배아 줄기 세포 문화에 쉽게 하 고 그들의 빠른 사이클 시간 덕분에 생 화 확 적인 실험에 필요한 큰 숫자를 신속 하 게 확장 될 수 있다. 건강 한 mESCs 더블 모든 12 헤
<li>MESC gelatinized 번호판에 원하는 번호를 확장 mESCs <ol>매체 (아래 참조) 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° c, 5% CO 2, 보관 및 &#62; 95% 습도. 
	참고: 3-5에 대 한 생물 학적 복제에 대 한 준비 한다 충분 한 격판덮개는 + 4SU 샘플-4SU 컨트롤. 한 10 cm 플레이트 (즉, 5-10 백만 셀)는 각 생물 복제에 게 충분 한 것 보다 더.</li>
	<li>MESCs에 대 한 매체 Dulbecco의 구성 &#39; s 수정이 글 &#39; s 매체 (DMEM) 보충 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), L-글루타민, 2mm 페니실린/스, 1 x 비 본질적인 아미노산, 100 µ M 베타-mercaptoethanol, 1000 U x 0.5 /mL 백혈병 금지 요인 (LIF), 3 µ M CHIR99021, 1 µ M PD0325901.</li>
	<li>뿌리고 mESCs, 전에 준비 10 cm 번호판의 원하는 수.
	<ol><li>확인 접시의 전체 표면을 커버 하 고 물에 0.1% 젤라틴의 4 개 mL를 추가, 실 온 (RT)에서 10 분 동안 품 어, 젤라틴 솔루션 제거.</li>
	</ol></li> <li>통행 셀에 도달할 때 접시, 당 ~ 10 백만 셀 일반적으로 다음 접종 ~ 48 h. 
	참고: mESCs 조밀한 식민지에서 성장, 접시 결코 허용 되어야 한다 monolayers (예: HEK293 또는 3T3 세포)에서 성장 하는 세포 라인에 대 한 관찰로 100 %confluency 도달. ~ 50 %confluent 매체 전에 확실히 노란색 때 mESC 접시를 passaged 해야 합니다.
	<ol>셀을 분리 하려면 <li>1 x 2 mM EDTA, 보충 버퍼링 인산 염 (PBS)에 한 번 밀도 mESC 문화 접시를 씻어 다음 0.05% trypsin DMEM에 녹아 추가 하 고 5 분 동안 인큐베이터에 접시를 반환 (37 ° C, 5% CO 2, 그리고 &#62; 95% 습도).</li>
		<li>인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 적극적으로 여러 번 위아래로 pipetting으로 DMEM의 동등한 양으로 셀 resuspend.</li>
		<li>Hemocytometer를 사용 하 여 셀 및 셀 단일 세포 현 탁 액을 형성 있도록 (즉, 없음 클러스터), 다음 실 온에서 5 분에 대 한 셀 혼합 500 x g 원심. 상쾌한을 제거 하 고 1-2 ml DMEM 셀 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>MESC 매체 (즉 800000 ~ 10 cm 접시 당 세포)에 10, 000 셀/c m 2의 조밀도에 세포를 접종 준비 단계 1.3.1에서에서 젤라틴 코팅 접시를 사용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 2. 단백질 Crosslink &#8211; 라이브 세포 상호 작용 RNA 참고: RNA-단백질 가교는 사진-활성화 ribonucleoside 아날로그 4-thiouridine (4SU)에 의해 중재입니다. 4SU는 내 생 보다 더 흡수도 최대 뉴클레오티드 RNA;로 통합 될 수 있다 고 따라서 중간 파장 UVB는 선택적으로 crosslink RNA 단백질 25 , 26를 사용할 수 있습니다. 4SU 치료 세포의 UVB 치료 리드 화학식 crosslinks에 4SU 포함 된 RNA 및 Tyr에 대 한 보고 선호와 아미노산 사이 Trp, 메트로, 리스, 그리고 Cys 27.
<li>1 단계에 설명 된 필요한 개수의 10 cm 번호판 확장 mESCs <ol>. 
	참고: 3-5에 대 한 생물 학적 복제에 대 한 준비 한다 충분 한 격판덮개는 + 4SU 샘플-4SU 컨트롤. 한 10 cm 플레이트 (즉, 5-10 백만 셀)은 각 생물 복제에 대 한 충분 한.</li>
	<li>판 confluency, 도달 하기 전에 추가 4SU 매체에 직접 500의 최종 농도에 µ M. 남겨 주세요-4SU 제어 요리 치료.</li>
	<li>균질 매체에 걸쳐 4SU 배포를 부드럽게 흔들어 접시. 2 시간에 대 한 동일한 조직 문화 인큐베이터에 그들을 반환 (37 ° C, 5% CO 2, 그리고 &#62; 95% 습도).</li>
	<li>접시 얼음 양동이 전송과 매체 삭제.</li>
	<li>씻어 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL와 함께 부드럽게 접시. 
	참고: 부드럽게 린스 또는 셀 분리 수 있습니다.</li>
	<li>UVB 방출 전구 장착 crosslinker에 뚜껑 없이 얼음 처럼 차가운 PBS와 장소 격판덮개의 2 개 mL를 추가 (312 nm). 1 J/c m 2의 에너지 설정에서 번호판을 비추는. 
	참고: 그것은 플라스틱 뚜껑 제거 하거나 자외선 으로부터 세포를 보호 하 고 가교를 방지 수 중요.</li>
	<li>셀 옮기는 사용 하 여 셀을 수집 하 고 전송 원뿔 관에 얼음 처럼 차가운 PBS. 5 분, 4 ° c.에 대 한 2000 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>는 상쾌한을 제거 하 고 5 mL 2 mM EDTA와 0.2 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF)와 얼음 처럼 차가운 PBS에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>수 세포는 hemocytometer를 사용 하 여입니다. 10 cm와 15 cm에서에서 5-10 및 10-20 백만 셀을 각각 기대.</li>
	<li>분리기 2000 x g에서 5 분, 4 ° c. 
	참고: 수송과 세포 수 있습니다 즉시 사용 3 단계 또는 플래시-액체 질소에서 냉동 하 고 무기한-80 ° C에서 저장 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 3. 핵의 절연 참고: 핵 세포질 단백질을 제거 하 고 핵 단백질의 범위를 증가에 격리 됩니다. 이 단계는 다른 세포질 격실에서 RBPs 공부 세포 분별 법의 다른 형태와 대체 될 수 있다.
<ol><li>준비 얼음 감기 (10 mM Tris HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 m m MgCl 2, 10mm KCl) 버퍼. 10 백만 셀 (으로 단계 2.9에서에서 계산) 당 적어도 2.5 mL를 사용 하 여 추출. 
	참고: 버퍼 A의 주식 (예를 들면: 500 mL 병) 미리 준비 고 6 개월 동안 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
	<li>사용 전에 0.5 m m dithiothreitol (DTT)와 0.2 밀리미터 PMSF 차가운 버퍼 A. 원하는 금액 (2.5 mL 당 10 백만 셀)을 추가</li> 하는 <ol>
	</ol></li> <li>10 백만 셀 당 2 mL 버퍼 A 사용 하 여 셀을 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 2500 x g에서 회전</li>
	<li>삭제 상쾌한 추가 버퍼 A octyl-phenoxy-polyethoxy-에탄올 등 비, 비 변성 시키기 세제의 0.2%와 보충 (재료의 표 참조), 500 µ L 당 10 백만 셀. 4 ° c.에서 5 분 동안 회전</li>
	<li>5 분에 대 한 2500 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>제거는 상쾌한, 세포질 없는 그대로 핵을 구성 하는 펠 릿. 
	참고: 핵 단계 4 또는 플래시-냉동 액체 질소에 대 한 즉시 사용 고 무기한-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 4. 핵의 세포 참고: 가교 된 핵은 단백질 및 단백질 RNA 복합물을 질량 분석 호환 버퍼에서 lysed.
10 백만 셀 당 200 µ L <ol><li>추가 세포의 용 해 버퍼 (9 M 요소, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 24 ° C). Chromatin는 1/8를 사용 하 여 기울이려면 sonicate &#34; 5-10 미에 대 한 50% 진폭 설정에서 프로브</li>
	<li>스핀 5 분 g x 12, 000와 수집 175 µ L의 펠 릿을 피하기 위해 상쾌한. 
	참고: 다음 RBR ID 단계 사용 됩니다 100 µ L 고 lysate의 나머지 75 µ L 나중에 사용 및 서쪽 오 점 분석-80 ° C에 저장 될 수 있다.</li>
	<li>측정 단백질 농도 Bradford 분석 실험 또는 유사한 기술 28을 통해. 다른 샘플을 1 mg/mL에서 단백질 농도 또는 세포의 용 해 버퍼의 적절 한 금액을 사용 하 여 낮은 샘플 농도 희석. 
	참고: 10 백만 mESCs의 핵에서 단백질의 100-200 µ g 기대.</li>
</ol> 5. 트립 신 소화 참고: 단백질 펩 티 드 s 생성 하 소화는하단-최대 질량 분석 (MS) 분석에 대 한의 uitable.
<ol><li>실시간에서 1 시간에 대 한 품 어 핵 lysate (5 m m 마지막); DTT 추가 솔루션</li>
	<li>신선한 주식 (최종 14 m m)에서 iodoacetamide를 추가, 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>50mm NH 4 HCO 3의 5 번 볼륨 lysate Dilute</li>
	<li>트립 신 추가 (µ g 단백질: µ g 트립 신 = 200: 1). 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol> 6. 펩 티 드의 담 <ol><li>샘플 당 하나의 맞춤 단계 팁 준비.
	<ol><li>6.1.1. 고체 상 추출 C18 물자의 디스크 200 µ L 피 펫 팁의 하단에 배치.</li>
		<li>추가 50 µ L 올리고 R3의 C18 디스크 위에 수 지 위상 반전. 원심 분리 어댑터 내부 단계 팁과 1.5 mL microfuge 관 내부 어댑터와 장소 팁.</li>
		<li>씻어 팁 추가 100 µ L 100% 이기. 용 매를 제거 하는 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기.</li>
		<li>평형 50 µ L 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA). 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기</li>
	</ol></li> <li>소화 단백질 샘플 2-3 pH 감소를 100% 포 름 산 추가. 
	참고:이 샘플 희석된 펩 티 드의 1 mL 당 ~ 5 µ L를 필요로 한다 하지만 pH 측정 하 고 더 개미의 산 추가 해야 합니다. 필요한 경우.</li>
	<li>맞춤 단계 팁, 샘플의 모든 때까지 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기에 부하 샘플 팁을 통해 간다.</li>
	<li>세척 바인딩된 펩 티 드 50 µ L 0.1 %TFA. 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>50 µ L 차입 버퍼를 추가 하 여 펩 티 드를 elute (75% 이기, 0.025 %TFA) 단계 팁을 팁에서 차입 버퍼를 1 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>건조 150g x 1 헤에 대 한 인민군 제 1-3에서 설정 진공 원심 분리기를 사용 하 여 샘플 
	참고: 말린된 펩 티 드 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 7. 가교 된 RNA의 제거 참고: 가교 된 RNA를 제거 하는 nuclease와 펩 티 드를 치료.
<ol><li>Nuclease 버퍼 (100mm NH 4 HCO 3, 4 m m MgCl 2) x 50 µ L 2에서에서 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>측정 펩 티 드 농도 280에서 흡 광도 사용 하 여 가정 1 mg/mL 1의 A 280에 대 한 펩 티 드의 nm. 
	참고: 예상된 농도 1 mg/mL.</li>
	<li>모든 샘플 1 mg/mL 또는 nuclease 버퍼 x 2를 사용 하 여 최저 농도 조정.</li>
	<li>50 µ L H 2 O + 1 µ L 고 순도 nuclease 마스터 믹스를 준비 (&#8805; 250 U) (테이블의 자료를 참조) 샘플 당.</li>
	<li>펩 티 드 샘플의 50 µ L 고 추가 50 µ L H 2 O + nuclease 믹스 마스터.</li>
	<li>품 1 h. 질량 분석을 수행 하는 진행에 대 한 37 ° C에서. 
	참고:는 펩 티 드 질량 분석에 대 한 준비가 이제 있습니다. 그들은 즉시 분석 하거나 무기한-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 8. 나노 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 원시 데이터 처리 참고: 4SU 가교는 펩 티 드의 질량 때문에, 그들의 이온 합산 되지 않습니다 비 가교 된 펩타이드의 농도 LC-MS/MS, 중 따라서는 가교에 의해 감소 될 것으로 보인다. 24 각 펩 티 드 단백질-RNA 가교의 정도 반영 하는 정도와이 감소의 일관성.
<ol><li>준비 HPLC 다음과 같이 버퍼: HPLC 급 물 (버퍼 A) 0.1% 포 름 산, HPLC 급 이기 (버퍼 B)에서 0.1% 개미 산.</li>
	<li>나노 HPLC를 사용할 수 있으면 다음 사양 나노 열 연결: 내부 직경 75 µ m; C18-AQ 입자; 포장 길이 20-25 cm. 
	참고: 사용할 수 있는 HPLC 높은 흐름 속도에서 실행 되는 경우 지정 된 유량에 대 한 적절 한 열 크기를 사용 합니다. 높은 흐름 크로마토그래피 감도 감소.</li>
	<li>프로그램 HPLC 방법은 다음과 같습니다: 흐름 속도 250-300 nL/분; 28 다음 5 분 동안 80 %B isocratic 80% B 10 분에서에서 120 분에 28% 버퍼 B에 2에서 그라데이션 
	참고:는 HPLC 자동된 열 평형 사전 샘플 로드 되어 있지 않으면, 시작 프로그램 0% B 10 분 샘플을 로드 하기 전에.</li>
	<li>MS 인수 메서드를 표준 샷건 proteomics 실험으로 데이터 종속 수집 (DDA) 프로그램. 악기 듀티 사이클 탠덤 MS 스캔 (또는 MS/MS)의 가장 강렬한 신호 전체 MS 검사 대체 한다. Proteomics MS 실행에 대 한 최적의 설정을 사용 하 여. 
	참고: 자신감의 결과 대 한 높은 해상도 모드 (예: orbitrap, 비행 시간)에 스캔 전체 MS 이상 수행할 수 있는 사용 악기. 정확한 정량화에 대 한 있는지 확인 전체 MS 검사 간의 간격으로 더 이상 보다 3 s. 더 듀티 사이클 추출된 이온 chromatograms의 정확한 정의 되지 않을 수 없습니다.</li>
	<li>는 HPLC 열에 샘플의 1-2 µ g를 로드 하 고 프로그래밍 HPLC-MS/MS 메서드를 실행 합니다. 각 생물 복제에 대 한 적어도 2 개의 독립적인 실행을 수행 하 고 그들을 치료 기술 복제.</li>
	<li>후 MS, MS/MS 스펙트럼 식별 및 추출 된 이온 크로마토그래피를 통해 펩 티 드 정량화에 대 한 proteomics 소프트웨어 패키지에 원시 파일을 가져올. 좋습니다 여러 컬럼에 맞춤 수행할 수 있는 소프트웨어 패키지 MS 실행 (참조 테이블의 재료) 29 , 30.</li>
	<li>옵션 소프트웨어 제품군에서 사용할 수 있는 경우에, 가능 하 게 &#34; 사이의 일치를 실행 &#34; 데이터 처리를 시작 하기 전에.</li>
	<li>분석 완료 되 면 수출 부 량 값과 함께 펩 티 드 목록.</li>
</ol>

<ol>
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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes.">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li><li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes.">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin.">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA.">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li><li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript,+Wrap53.">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells.">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells.">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li><li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells.">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions.">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+U1+snRNP,+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle,+reveals+the+mechanism+of+5'+splice+site+recognition.">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li></ol>

저자는 공개 없다.

자세한 실험 프로토콜 RBR-ID를 mESCs로 하 고, RNA 4SU를 통합할 수 있는 모든 셀에 적절 한 수정 수행을 설명 합니다. 다른 세포 유형 충분 한 신호 대 잡음 비를 되도록 접근 방법의 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 프로토콜 설명 여기 핵 RBPs 시험에 초점을 맞추고, 하는 동안 RBR-ID 기술 한다 쉽게 적용할 cytosol 또는 특정 세포와 같은 다른 세포질 구획 다른 분류를 사용 하 여 전략입니다. 최적화 ?...

RBR ID 방법의 목적은 새로운 RNA 의무적인 단백질 (RBPs)를 식별 하 여 펩 티 드 수준 해상도 RNA 바인딩 돌연변이의 디자인 및 생물학 및 생 화 확 적인 조사를 촉진 하기 위하여 그들의 RNA 바인딩 영역 (RBRs) 지도 단백질 RNA 상호 작용의 기능입니다.
RNA는 생체 중 고유 수 모두 유전 정보를 운반 하는 메신저 역할을 하 고도 생화학 기능 단백질1,2의 유사 더 많은 복잡 한 3 차원 구조에 접어. 증거의 성장 시체 noncoding RNAs (ncRNAs) 다양 한 유전자 규정 하는 후 성적인 경로3,,45 에 중요 한 역할을, 일반적으로, 이러한 규정 하는 기능 콘서트 중재는 제안 특히 주어진된 RNA와 상호 작용 하는 단백질 특정 한 관련성의 상호 작용 단백질의 집합 최근 심각 하 게 공부 긴 ncRNA (lncRNA) Xist,이 lncRNA 여성 셀6,7 x 염색체 비활성화를 중재 하는 방법에 대 한 값진 통찰력을 제공에 대 한 확인 되었다 ,8. 특히, 이러한 Xist 상호 작용 단백질의 몇 없는 어떤 정식 RNA 바인딩 도메인9, 그리고 그러므로 그들의 RNA 바인딩 작업 수 없습니다 예측 철에서 혼자 그들의 기본 시퀀스에 따라. LncRNAs의 수천 어떤 주어진된 셀10표현 됩니다 고려, 아직 될 RNA 의무적인 단백질 (RBPs) 발견 그들 중 많은와 상호 작용을 통해 행동 수도 있습니다 가정 하는 합리적입니다. 이러한 소설 RBPs 식별 하는 실험적인 전략 것입니다 따라서 크게 용이 하 게 ncRNAs의 생물 학적 기능 해 부의 작업.
RBPs 경험적으로 식별 하는 이전 시도 polyA + RNA 선택 질량 분석 (MS)11,12,13,,1415에 결합에 의존 했습니다. 비록이 실험 상 상속 RBPs의 목록에 많은 단백질을 추가, 디자인에 의해 그들은 감지할 수 단백질 polyadenylated 성적표에 바인딩된. 그러나, 대부분의 작은 RNAs 및 많은 lncRNAs polyadenylated 되지 않습니다. 16 , 17 그리고 그들의 상호 작용 단백질 것 가능성이 되었습니다 놓친이 실험에서. 최근 연구 공동 여러 알려진된 RBPs와 정화 하 고 이러한 재발 RBP 파트너 RNA 바인딩 활동18보유 가능성이 것으로 나타났다 단백질을 식별 하기 위해 단백질-단백질 위하여 데이터베이스에 기계 학습을 적용. 그러나,이 방법은 기존의 큰 상호 작용 데이터베이스 마이닝에 의존 하며만 공동 알려진된 RBPs, 따라서 불용 성, 막 임베디드 및 부족 한 분석에서 제외 된 비 변성 시키기 조건에 순화 될 수 있는 단백질을 확인할 수 있습니다. 단백질입니다.
Id는 단백질의 한 진실 fide RBP로 종종 단백질 RNA 상호 작용의 생물학 및 생 화 확 적인 기능에 대 한 정보를 자동으로 생성 하지 않습니다. 해결 하기 위해이 시점, 그것은 일반적으로 특정 돌연변이 각 소설 RBP19, 의 맥락에서 RNA 바인딩 기능을 테스트 하도록 설계 된 수 수 있도록 단백질 도메인 및 아미노산 잔류물 상호 작용에 관련 된 식별 하는 것이 좋습니다. 20. 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해 이전 노력 사용 재조합 형 단백질 파편 삭제 돌연변이 RNA 바인딩 영역 (RBRs)19,20,,2122;을 식별 하 그러나, 이러한 접근은 노동 집약 및 높은 처리량 분석와 호환 되지 않는. 더 많은 최근 연구 질량 분석23;를 사용 하 여 높은 처리량 패션에서 RNA 바인딩 활동을 지도 하는 실험적인 전략 설명 그러나,이 방법은 이중 polyA + RNA 선택에 의존 하 고 따라서 위에서 설명한 RBP 식별 방식으로 동일한 제한 실시.
우리 나 RNA 바인딩 영역 id RBR-, photocrosslinking 단백질-RNA와 단백질 및 단백질 영역 만들기 없이 라이브 세포에서 RNA 상호 작용을 식별 하기 위해 양적 질량 분석을 이용 하는 기술 개발 RNA polyadenylation 상태에 가정, polyA RNAs24에 바인딩된 따라서 RBPs를 포함 한. 또한,이 방법은 가교를 독점적으로 의존 단백질 가용성 또는 액세스 가능성 요구 사항은 없습니다 고 따라서 내 막 (예: 핵 봉투) 또는 가난 하 게 녹는 구획 (RNA 바인딩 활동 지도에 적합 예를 들어 핵 매트릭스)입니다. 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 핵에 대 한 RBR-ID를 수행 하는 실험 단계 설명 하지만 사소한 수정이 프로토콜 적합 해야한다 다양 한 세포 유형, 그들은 효율적으로 문화에서 4SU를 통합할 수 있는 중간입니다.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, qualified, US origin</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution 200 mM</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&amp;times;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin solution,2% in water</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>50 mM stock in water</td></tr><tr><td>Spectrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, sequencing grade</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore solid phase extraction disk</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 Reversed - Phase Resin</td><td>Fisher Scientific</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td>High purity nuclease</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator Model 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>discontinued</td><td>updated with FB505110</td></tr><tr><td>HPLC grade acetonitrile</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC grade water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>Packing material for HPLC column</td></tr><tr><td>Capillary for nano columns (75 &amp;micro;m)</td><td>Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant software</td><td>Max Planck Institute for Biochemistry</td><td></td><td>Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs</td></tr></tbody></table>

sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions

Noncoding RNAs 유전자 발현, chromatin 구조, 및 DNA 복구 통제 등 여러 가지 핵 프로세스에서 중요 한 역할을 재생 합니다. 대부분의 경우에서 noncoding RNAs의 행동은 누구의 기능 차례로 noncoding RNAs와의 이러한 상호 작용에 의해 통제 된다 단백질에 의해 중재 됩니다. 이 일치, 핵 기능에 관련 된 단백질의 증가 RNA를 바인딩할 보고 되었습니다 그리고 몇 가지 경우에이 단백질의 RNA 바인딩 영역 매핑 되었습니다, 자주 힘 드는, 후보 기반 방법을 통해.
여기, 우리는 RNA 의무적인 단백질 및 RNA 바인딩 영역 그들의 높은 처리량, 프로테옴 전체 편견된 식별을 수행 하기 위해 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 방법론 photoreactive uridine 아날로그 세포질 RNA, UV 중재 단백질-RNA 가교 및 질량 분석 분석 공개는 프로테옴 내 RNA-가교 된 펩 티 드에서에서의 설립에 의존 합니다. 마우스 배아 줄기 세포에 대 한 절차를 설명 하 고, 비록 배양된 세포의 다양 한 프로토콜을 쉽게 적응 한다.

그림 1 RBR ID 워크플로를 보여 줍니다. 때문에이 기술은 상대적으로 낮은 가교 효율 생물 복제 걸쳐 고갈 수준 및 관찰 된 효과 (P-값)의 일관성을 고려 하는 매우 중요 하다. 그림 2 는 RBR ID 결과의 화산 줄거리. 펩 티 드 RNA 승인 주제 (RRM) 도메인을 겹쳐 높게 일관 된 고갈 수준 표시. RRM 도메인 RBR ID 분석에 대 한 긍정적인 ?...

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Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.0K 조회수.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. 우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

연구

유전학

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

RNA 측정 방법<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup세포와 조직에서&gt; -methyladenosine 수정

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

생화학

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a complementary DNA (cDNA) intermediate. However, such approaches are rarely applied as a de novo RNA sequencing method, but used mainly as a tool that can assist in quality assurance for confirming known sequences of purified single-stranded RNA samples. Recently, we developed&#160;a direct RNA sequencing method by integrating a 2-dimensional mass-retention time hydrophobic end-labeling strategy into MS-based sequencing (2D-HELS MS Seq). This method is capable of accurately sequencing single RNA sequences as well as mixtures containing up to 12 distinct RNA sequences. In addition to the four canonical ribonucleotides (A, C, G, and U), the method has the capacity to sequence RNA oligonucleotides containing modified nucleotides. This is possible because the modified nucleobase either has an intrinsically unique mass that can help in its identification and its location in the RNA sequence, or can be converted into a product with a unique mass. In this study, we have used RNA, incorporating two representative modified nucleotides&#160;(pseudouridine (&#936;) and 5-methylcytosine (m5C)), to illustrate the application of the method for the de novo sequencing of a single RNA oligonucleotide&#160;as well as a mixture of RNA oligonucleotides, each with a different sequence and/or modified nucleotides. The procedures and protocols described here to sequence these model RNAs will be applicable to other short RNA samples (&#60;35 nt) when using a standard high-resolution LC-MS system, and can also be used for&#160;sequence verification of modified therapeutic RNA oligonucleotides.&#160;In the future, with the development of more robust algorithms and with better instruments, this method could allow sequencing of more complex biological samples.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

Here, we describe a detailed protocol for an LC-MS-based sequencing method that can be used as a direct method to sequence short RNA (&#60;35 nt per run) without a cDNA intermediate, and as a general method to sequence different nucleotide modifications in a single study at single-base precision.

2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers and modulators. While these dynamic states remain hidden to most structural methods, R1&#961; relaxation dispersion (RD) spectroscopy allows the study of conformational dynamics in the micro- to millisecond regime at atomic resolution. The use of 1H as the observed nucleus further expands the time regime covered and gives direct access to hydrogen bonds and base pairing.
The challenging steps in such a study are high-purity and high-yield sample preparation, potentially 13C- and 15N-labeled, as well as setup of experiments and fitting of data to extract population, exchange rate, and secondary structure of the previously invisible state. This protocol provides crucial hands-on steps in sample preparation to ensure the preparation of a suitable RNA sample and setup of 1H R1&#961; experiments with both isotopically labeled and unlabeled RNA samples.

We present a protocol to measure micro- to millisecond dynamics on 13C/15N-labeled and unlabeled RNA with 1H R1&#961; relaxation dispersion nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The focus of this protocol lies in high-purity sample preparation and setup of NMR experiments.

RNA의 1 H R 1θ 이완 분산 실험의 샘플 준비 및 설치의 실제적인 양상

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

생물학

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

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빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA 측정 방법

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

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Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

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PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로