이 프로토콜은 수행이 간단하고 실험실의 범위 내에서 하기 쉽기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜은 인간 또는 마우스 샘플에서 HLA 또는 MHC 유형 I 또는 유형 II 펩티드의 분리를 허용한다. 이 방법은 암, 바이러스학 또는 자가 면역 질환에서 면역 체계와 관련된 모든 연구 영역과 관련된 과학적 질문을 해결할 수 있습니다.
이 프로토콜은 실험실에서 일하는 모든 사람이 액세스할 수 있도록 제작되었습니다. 그냥 단계를 따르십시오. 샘플당 80밀리그램의 무게를 측정하여 15밀리리터 원내 튜브로 이송하여 세포산 시아노겐 브로마이드 구슬을 활성화하기 시작합니다.
1밀리머 염산 5밀리리터를 추가합니다. 파이펫은 말린 구슬의 재침을 용이하게하기 위해 5번 위아래로, 원뿔관을 1밀리머염산8.5밀리리터로 채웁니다. 회전기 장치를 사용하여 실온에서 30 분 동안 20 RPM에서 구슬을 회전합니다.
실온에서 2분 동안 200x G의 구슬을 원심분리하고 포부로 상부를 제거합니다. 500 마이크로리터의 커플링 버퍼를 비즈 팔레트에 추가한 다음 비드 서스펜션을 새로운 2밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 따로 둡니다. 이러한 구슬에 항체를 결합하기 위해, 새로운 2 밀리리터 마이크로센심심분리기 튜브에 선택된 항체의 2 밀리그램을 추가하고 커플링 버퍼 용액으로 1 밀리리터에 볼륨을 구성하여 밀리리터당 2밀리그램의 최종 농도를 얻습니다.
이전에 준비된 비드 용액을 전송하고 항체 용액에 추가합니다. 이어서, 회전기 장치를 이용하여 120분 동안 20RPM에서 마이크로센트심분리기 튜브를 회전한 다음, 구슬을 원심분리한 다음, 이전에 설명한 바와 같이 상체를 제거한다. 이제 먼저 항체 결합 구슬을 포함하는 마이크로 센트심분리기 튜브에 0.2-어자글리신 1밀리리터를 추가하고 회전기 장치를 사용하여 실온에서 60분 동안 20 RPM에서 회전하여 구슬의 차단 및 세척을 시작한다.
원심 분리 및 상체 제거 후, 1 밀리리터 PBS로 구슬을 씻고, 원심 분리에 의해 상퍼를 제거하고, 사용까지 4섭씨에서 PBS의 1 밀리리터에 구슬을 저장합니다. MHC 급 I 또는 II 펩티드를 분리하려면 손바닥으로 튜브의 바닥을 따뜻하게하여 1억 개의 셀의 냉동 팔레트를 해동하십시오. 서스펜션이 균일해질 때까지 500마이크로리터의 PBS를 팔레트와 파이펫에 위아래로 추가합니다.
새로운 2밀리리터 미세원심분리기 튜브에서 서스펜션을 옮기고 동일한 양의 세포 용해 버퍼를 추가합니다. 회전기 장치를 사용하여 섭씨 4도에서 60분 동안 10RPM에서 회전합니다. 원심 분리기 는 18, 000x G에서 풀 브레이크로 섭씨 4도에서 20 분 동안 용액을 분리하고 새로운 2 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에서 상퍼를 전달합니다.
원심분리에 의해 항체 결합 구슬을 회수하고 상체를 제거한다. 이어서, 세포용액을 항체 결합 구슬로 옮기고, 회전기 장치를 사용하여 섭씨 4도에서 14~18시간 동안 10RPM에서 배양한다. 둘째 날, 폴리 프로필렌 기둥의 아래쪽 뚜껑을 제거하고, 열을 폴리 프로필렌 기둥 랙에 놓고, 흐름을 수집하기 위해 아래에 빈 용기를 설치합니다.
이제 버퍼 A의 10 밀리리터로 폴리 프로필렌 컬럼을 헹구고 중력에 의해 배수합니다. 액체 용출의 유속이 너무 느리면 폴리 프로필렌 컬럼의 바닥 끝을 더 잘라냅니다. 구슬/리자이트 혼합물을 측정하고 수집하고 폴리프로필렌 컬럼으로 옮기습니다.
액체 혼합물을 중력에 의해 엘로트하자. 선택적으로, 수집하고 서양 블로팅에 대한 알리 쿼트의 20 마이크로 리터를 동결. 이제 버퍼 A의 10 밀리리터를 추가하고 중력에 의해 elute시키는 하여 폴리 프로필렌 컬럼에 보관 된 구슬을 씻으라.
랙에서 폴리프로필렌 컬럼을 제거하고 컬럼과 튜브를 손으로 잡고 새로운 2밀리리터 미세 원심 분리기 튜브 위에 놓습니다. 폴리프로필렌 컬럼에 1%TFA의 마이크로리터 300개를 넣고 5회 위아래로 배관하여 구슬을 섞는다. 그런 다음, 새로운 2 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 용액을 전달합니다.
MHC 펩티드를 탈염하고 용출하기 위해 C-18 컬럼 위에 메탄올 200 마이크로리터를 넣고 1, 546x G에서 원심분리기를 3분간 추가하여 흐름을 폐기합니다. C-18 열 위에 0.1%TFA에 80%의 아세토나이트 200마이크로리터를 추가하고 다시 원심분리기를 추가하여 흐름을 폐기합니다. 그런 다음 0.1%TFA의 마이크로리터 200기를 추가하여 유동을 원심분리합니다.
마지막으로, C-18 컬럼 위에 MHC 펩티드 복합체의 200마이크로리터를 적재하고, 원심분리를 통해 흐름을 버리고, 완전한 부피가 로드될 때까지 반복한다. 다음으로, 0.1%TFA의 200 마이크로리터, 원심분리기를 추가하여 흐름을 폐기하고 C-18 컬럼을 새로운 2밀리리터 마이크로센트심리후지 튜브로 옮기고, ELute MHC 펩티드를 0.1%TFA에 28%의 아세토닐트리에 150마이크로리터를 첨가하여 추가한다. 원심분리 후, 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 흐름을 수집합니다.
총 450마이크로리터에 대해 용출 공정을 두 번 반복하고 LC-MS-MS에 의해 분석될 때까지 영하 20도에서 동결합니다. 질량 분광계에서 MHC 급 I 및 II 펩티드의 식별을 위해 이러한 정제 된 펩티드를 사용합니다. 구슬의 결합 효율은 비드가 결합하기 전에 항체에 비해 CNBr 구슬에 동형으로 결합될 때 빛과 무거운 사슬의 신호 염색 강도의 현저한 감소에 의해 설명되었다.
산성 용출에 따른 MHC 펩티드 복합체의 격리는 항할-ABC 중형항체를 이용한 MHC 펩티드 복합체의 강력한 검출 신호에 의해 확인되었다. 현재 프로토콜을 이용한 결과의 개별 간 재현성도 추정되었다. 3개의 상이한 생물학적 복제에 걸쳐 검출된 펩타이드수에 대한 평균 변이 계수는 작으며, 이는 1.9~11%로 다양했지만, 펩타이드의 정체는 상당히 다양하며, 3개의 생물학적 복제에서 재현가능하게 검출된 펩타이드의 비율은 39%에서 63%까지 다양하여 생성된 열맵은 확인된 펩타이드의 MHC 강도를 예측한 것으로 나타났다.
마우스 MHC 클래스 I 및 클래스 II 펩티드의 경우, 전제된 강하거나 약한 바인더는 각각 89% 및 87%였다. 인간 HLA 클래스 I 및 클래스 II 펩티드의 경우, 근거가 강한 또는 약한 바인더는 각각 97 및 70 %였다. LHC 급 I 및 클래스 II 펩티드에 대한 마우스와 인간의 펩티드 결합 모티브도 생성되었다.
이 프로토콜의 최적화 이전에, 뮤린 MHC 클래스 I와 II 펩티드의 격리는 매우 어려웠다. 이 최적화된 프로토콜은 생체 내 마우스 모델에서 murine MHC 클래스 I 및 II 펩타이드의 분리를 용이하게 할 것이며, 예를 들어, 많은 다양한 질병 관련 연구의 검증을 위해 일상적으로 사용된다.
