우리는 배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경 줄기 세포를 재활성화하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 배양 배지에 외인성 인자를 공급할 수 있고 신경세포 재활성화를 분석할 수 있다. 더 나은 줄기 세포 치료법은 정지 된 줄기 세포가 외인성 단서에 어떻게 반응하고 세포주기에 진입하는지에 대한 더 나은 이해에 의해 개발 될 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 과학자 인 Susan Doyle이 될 것입니다. 조심스럽게 해부 현미경으로 포도 한천 접시에서 약 20 ~ 25 마리의 갓 부화 한 유충을 선택하십시오. 약 두 밀리리터의 PBS로 페트리 접시를 채우고 PBS에 유충이 들어있는 도구의 팁을 두 분 동안 담그십시오.
두 분 후, 바닥에 액체를 풀링하기 위해 접시를 비스듬히 팁하고 작은 페인트 브러시를 사용하여 페트리 접시의 바닥을 위로 액체에서 애벌레를 닦으십시오. 페인트 브러시에있는 모든 유충을 모으고 유충을 PBS가 들어있는 페트리 접시로 다시 옮기기 전에 70 % 에탄올로 간단히 헹구십시오. 작업 영역, 해부 도구, 포셉 및 두 개의 유리 시계 접시에 70 % 에탄올을 뿌리고 벤치에서 말리십시오.
보충 된 슈나이더의 배양 배지 또는 SSM을 만들어 얼음 위에 놓습니다. 각 유리 시계 접시에 매체 한 밀리리터를 피펫하십시오. 멸균 팁이있는 마이크로 피펫을 사용하여 PBS 플레이트에서 갓 부화 한 유충을 첫 번째 유리 시계 접시의 SSM으로 옮깁니다.
해부 현미경으로 포셉을 사용하여 SSM으로 두 번째 유리 시계 접시에 놓인 유충에서 뇌를 해부하고 필요에 따라 배율을 조정하십시오. 하나의 포셉을 사용하여 입 후크를 잡고 다른 하나는 부드럽게 몸을 반쯤 잡고 반대 방향으로 당겨 유충을 두 조각으로 나눕니다. 15~20개의 뇌를 해부한 후 1밀리리터의 SSM을 멸균된 24웰 배양 트레이의 한 웰에 추가합니다.
마이크로 피펫과 멸균 팁을 사용하여 갓 해부 된 뇌를 SSM으로 옮긴 다음 섭씨 25도에서 24 시간 동안 뇌로 매체를 배양합니다. 990 마이크로리터의 SSM과 함께 5-에티닐-2'데옥시우리딘 또는 EDU의 10 밀리몰 스톡의 피펫 10 마이크로리터를 멸균 마이크로원심분리 튜브에 넣고 혼합한 다음, EDU SSM 1밀리리터를 멸균 12-웰 배양 트레이의 한 웰에 피펫팅한다. SSM을 함유하는 웰로부터 멸균 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 뇌를 EDU SSM 용액을 함유하는 새로운 웰로 옮기고 섭씨 25도에서 한 시간 동안 인큐베이션한다.
다음으로, EDU 라벨이 붙은 뇌를 한 밀리리터의 고정제가 들어있는 동일한 배양 트레이의 다른 웰로 옮기고 뇌가 20 분 동안 고정되도록하십시오. 고정 후 마이크로 피펫을 사용하여 뇌를 72 웰 미니 트레이 웰로 신속하게 옮깁니다. PBT 10 마이크로 리터로 뇌를 세 번 헹구고 각각 10 분 동안 세 번 세척을 반복하여 뇌가 항상 액체로 덮여 있는지 확인하십시오.
뇌에 10 마이크로 리터의 블로킹 용액을 피펫. 트레이를 덮고 가장자리 주위에 파라필름 스트립으로 밀봉하십시오. 이 그림은 인슐린 염색으로 SSM에서 24 시간 배양 한 후 대형 EU 양성 및 데드 팬 양성 신경 세포 세포를 보여줍니다.
인슐린이 없는 슈나이더의 배지에서 24시간 후, 갓 부화한 오리건 R 야생형 뇌는 4개의 버섯 몸 신경아세포와 하나의 심방측성 신경아세포 외에는 큰 크기의 EDU 양성 및 데드팬 양성 신경아세포 세포가 없었다. 공초점 이미징 동안, 외삽 된 뇌 조직의 작은 구멍에서 큰 크기의 구멍과 같은 손상이있는 일부 뇌 반구가 때때로 관찰되었습니다. 구멍이있는 뇌는 분석에 사용되지 않았습니다.
조직 손상을 피하기 위해 조심스럽게 조직을 해부하고 피펫을 부드럽게 해부하십시오. 또한 가능한 한 멸균되고 문화를 오염시키지 않도록 노력하십시오. 배양 배지는 다른 인자를 추가함으로써 쉽게 조작될 수 있기 때문에, 이 기술은 외인성 신호전달 및 신경아세포 정지 진입 및 출구에 관한 미래의 가설을 다루기 위해 사용될 수 있다.
