NIH 지원 / NIDCD R01 DC 011582. 이미징 실험은 콜로라도 앤 슈츠 의료 캠퍼스 고급 광학 현미경 코어의 대학에서 수행 하였다는 NIH / NCRR 콜로라도 CTSI 허가 번호 UL1 RR025780과 록키 마운틴 Neurlogical 장애 코어 센터 보조금 NIH P30NS048154에 의해 부분적으로 지원. 솔크 연구소에서 박사 샤샤 뒤 락은 GlyT2-GFP 마우스를 우리에게 제공했다.

1. 광학 유전자형 마우스 새끼 1. 광학 유전자형 <ol><li> 적합한 여기 파장의 레이저 포인터를 이용하여 각각의 형광 마커의 발현을 검사 (여기 기재된 실험에서 405 ㎚) 및 여기 파장을 차단하는 필터 고글 대응하지만, 발광 파장을 전달 (450 - 여기에 설명 된 실험에서 700 ㎚) . 헤드 또는 마우스 새끼의 척수의 뒤에 레이저 포인터를 가리 키 (도 1 참조). 눈과 레이저 빛에 피부의 긴 노출에 레이저를 빛나는하지 마십시오. </li></ol> 이전 동물 2. 광학 유전자형 <ol><li> 깊이 복강 내 주사 (120 ㎎ / ㎏ 체중)을 통해 펜 토바 비탈의 과다 복용으로 (여기에 설명 된 실험에서 P138에 세 P14) 마우스를 마취. 동물의 반사 신경을 확인하여 적절한 마취를 확인 (잠​​시 일의 끝을 꼬집어전자 귀 또는 뒷다리 중 하나는 귀 또는 다리)의 수축 반사를 유도합니다. </li><li> 참고 : 동물이 여전히 이상적으로 (즉, 그 중심은 여전히 박동) 살아 있기 때문에 펜 토바 비탈 (120 ㎎ / ㎏ 체중)의 과다 복용의 사용에도 불구하고 우리는 대신 안락사의 &quot;깊은 마취&quot;로 주입 절차를 참조 할 때 수술 및 관류이 시작됩니다. 이것은 뇌를 포함한 내부 장기의보다 효율적인 관류을 보장한다. </li><li> 동물 모든 반사 작용을 보여주지 않는다 일단 신중 머리 뒤쪽을 덮는 피부 절개를 만들고 두개골의 중앙부를 절단하여 두개골 (도 2a)를 덮는 피부를 제거한다. 레이저 광에 폭로 두개골을 노출시켜 전술 한 바와 같이 필터 고글 통해 형광을 관찰한다. GFP 양성 신호가 관찰되는 경우, 다음의 형태를 안락사 보장 / 잘린 통해 동물을 희생하지 않으면 초 (2 단계로 진행 우리IACUC 규정). </li></ol> 참고 : 형광이 동물의 눈을 통해 관찰 할 수있다 (&gt; 1 개월)도 나이가 쥐에서. 2. Transcardial 관류 및 뇌 준비 <ol><li> 빙냉 인산염 완충 식염수로 transcardially 관류; 크게로부터 혈액을 제거하는 30 G 주사기 바늘을 이용하여 (PBS의 NaCl : 10mM의 137 mm의 KCl을 2.7 mm의 KH 2 PO 4 : 1.76 mm의 나 2 HPO 4) 동물. <ol><li> 첫째, 신중하게 날카로운 가위로 흉곽을 열고 심장의 좌심실에 바늘을 밀어 넣습니다. 심장과 대동맥에 PBS를 펌핑 바로이 단계는 몸을 종료 혈액 수 있도록 가위로 심장의 우심방을 열고 다음 시작합니다. 주 : 관류 5 얻어 - 동물의 크기에 따라 10 분. </li></ol></li><li> 관류를 통해 방혈 한 후, 동물의 목을 벨 핀 N으로 머리를 보호eedles (30 G 주사기 바늘) 준비 접시에 눈 소켓을 통해 피어싱과 두개골에서 뇌를 제거하여. <ol><li> 우선, 두개골을 오버레이 피부를 봉쇄하는 날카로운 가위를 사용 뒤통수에 작은 절개를 한 후 단지 미부 동물의 눈의 측면에 절단 헤드의 등쪽에 정중선을 따라 잘라 및 꼬리 방향 마지막 절단은 완전히 머리 뒤쪽에 피부의 플랩을 제거한다. </li><li> 이 크게 결국 뇌간의 제거를 단순화하기 때문에 다음, 두개골 자체에 대한 동일한 절단 패턴을 반복, 그 과정에서 모두 cochleas을 제거해야합니다. 이 절차 후 뇌의 꼬리 절반이 완전히 노출 거짓말한다​​. </li><li> 다음 단계에서, 소뇌에서 약 45 ° 내지 약 2mm의 입쪽의 각도 전체 전뇌를 통해 절단하는 날카로운 면도날 또는 메스를 사용한다. AB와 뇌의 분리 전면 절반을 특종ENT 주걱. </li><li> 그 입쪽 끝에 뇌의 절반을 상승 꼬리이어서 여전히 복부쪽에 뇌간 접속되어 뇌신경 통해 잘라 주걱을 사용한다. 최종 결과로서, 뇌간을 포함한 뇌의 꼬리 절반 준비된 동물 머리의 나머지 떨어져 자유롭게 낙하한다. </li><li> 그것의 복부 측면을 노출하는 뇌의 제거 꼬리 반 플립과 사다리꼴 본체를 포함하는 복부있는 &quot;전구&quot;의 (선행 성 주사에 대한) 단지 주동이의 관상면을 따라 절단 또는 (역행 주사에 대한) 바로 꼬리 (단계 참조 2.3). <ol><li> 언제나 조직에 과도한 기계적 스트레스에 의한 세포 사멸을 최소화하기 위해 절단 과정을위한 날카로운 면도날 또는 메스를 사용한다. 최종 결과로서, 길이가 약 1cm에 걸친 다른 뇌 영역을 따라 완전한 우수한 olivary 착체를 함유하는 뇌 이식편을 수득 한 것이다. </li></ol></li></ol> &lt;/ 리&gt; </ol> 주 :이 프로토콜은 청각 뇌간 위치한 사다리꼴 체로 트레이서 주입하는 절차를 보여준다. 필요에 따라, 절삭면과 주사 부위의 위치 및 방향을 적응. 들이 식별되고 뇌를 절단하지 않고 분사 될 수 있도록 뇌의 표면에 충분히 가까이 관심 거짓말의 형광 뇌 영역 (도 2b 참조) 경우, 관상 절단 공정을 생략 할 수있다. <ol start="3"><li> 사다리꼴 본체 (VNTB)의 복부 핵을 포함하는 두 복부 눈에 띄는 &quot;전구&quot;로 사다리꼴의 몸을 확인합니다. </li></ol> 참고 :이 절삭면의 대략적인 정위 위치에 대한 자세한 해부학 참고로, MM은 Tz 일 &quot;로 표시 사다리꼴 몸 (= MNTB)의 내측 핵을 보여줍니다, 브레 그마 ~ -5.7를 아틀라스의 프랭클린 &amp; Paxinos, 2008 년 패널 (78)을 참조 &quot;. 패널 (69)는 사다리꼴 보의 복부 핵을 보여줍니다&quot;MVPO&quot;(medioventral periolivary 핵) (19)로 표시 DY (VNTB). 3. 선행 성 / 역 행성 추적 참고 : RT (25 ℃)에서 모두 다음 절차를 수행합니다. <ol><li> 125 mm의의 KCl : 2.5 mm의의 MgCl 2 : 1 mm의 CaCl2를 0.1 mM의 포도당 절단 후 (95 % O 2, 5 % CO 2) 해부 용액 (NaCl을 산소 함유 제제 접시에 뇌간 이식편 배치 25 mm의의 NaH 2 PO 4 : 1.25 mm의 NaHCO3을 25 mm의 아스코르브 산 : 0.4 mm의 이노시톨 : 3 mm의 피루브산 2 mM)을 30 G 주사기 바늘을 고정. 분사의 영역이 위쪽으로 향하도록합니다. </li><li> 붕규산 유리 주입 피펫을 당겨 다음과 같은 세 가지 솔루션 중 하나를 채우기 : choleratoxin 서브 유닛-B PBS 12 ~ 13에서 알렉사 형광 (555)에 결합 된 (주로 역행 전송에 사용), B의) 1.0 ㎎ / ㎖ 솔루션 ) 1 % -d10,000 MW 덱스 트란 TRITC-555의 0.9 % 식염수, 덱스 트란 (주로 역행 수송에 사용 MW 3,000) 555 테트라 메틸 또는 c) 1 % -dilution 0.9 % 식염수에 ilution (주로) 선행 성 전송을 위해 사용된다. <ol><li> 4 당겨주기 - 2.5에서 3.5 옴과 그들이 3에서 제조되는 것을 주입 피펫 저항 범위를 확인합니다. 여기 기재된 실험을 위해, 피펫 풀러에 미리 프로그램 당기는 알고리즘을 선택함으로써 이것을 달성한다. </li></ol></li><li> 적절한 파장의 정적으로 탑재 레이저 포인터 사용 뇌 이식편 조명 (도 3a에 &#39;2&#39;번 항목을 여기서 설명한 실험에서 405 nm 파장). 주사를위한 가이드로 레이저 포인터를 사용하고, 형광 표지 된 뇌 핵 또는 주입 될 관심 셀에 레이저 빔을 목표로한다. </li><li> (70) - 호환 필터 고글 (450를 입고있는 동안 찾아 쌍안 현미경을 통해 조사 대상 지역을 관찰여기에 설명 된 실험) 0 nm의 대역 통과 필터. 관심의 영역으로 미세 조작기를 통해 주입 전극을 삽입합니다. </li><li> 추적 물질을 주입한다. 뇌 단면 내의 관심 영역 (ROI)의 영역과 수직으로 향하는 압력 분사 장치를 사용하여, 50 밀리 초마다 15 psi에서 10 압력 펄스 - 주사는 2로 구성된다. 염료가 확산 할 수 있도록 15 초 - (10)의 간격으로 각각의 압력 맥동을 관리. </li><li> 테트라 메틸 (TRITC) 주사제의 경우에는, 추가로 (여기에서 설명 된 실험과 MNTB VNTB) 관심의 뇌 영역에 배치 된 전극을 통해 전기 염료 흡수를 강화하기 위해 전기 자극한다. <ol><li> 자극 분리 장치 (그림 3B의 항목 번호 7, 9)와 55 V로 자극에 의해 구동 증폭 간격 interpulse 50 밀리, 50 밀리 초 8 볼트의 8 TTL 펄스를 사용합니다. 이 프로토콜, adminis의 20 반복 - (10)를 사용하여몇 분 7,8에 걸쳐 tered. 제대로 전극을 접지하십시오 - 접지선은 목욕 솔루션에 연결해야합니다! </li></ol></li><li> 분사의 성공을 확인합니다. 긴 발광 파장과 형광 트레이서도 단파장 레이저 여기시 형광 신호를 방출하기 때문에, 시각적으로 레이저 영역을 조명하고 상기 필터 고글 통하여 관찰하면서 주입 대상 영역 확산 염료 흡수 / 확인. </li></ol> 4. 배양 <ol><li> 주입 후, 산소 인공 뇌척수액에서 (ACSF을 brainstems을 품어, 염화나트륨 : 125 밀리미터,의 KCl : 2.5 mm의의 MgCl 2 : 1 밀리미터, 염화칼슘 2 : 2 밀리미터, 포도당 : 25 밀리미터,의 NaH 2 PO 4 : 1.25 밀리미터, NaHCO3을 25 mm의 아스코르브 산 : 0.4 mm의 이노시톨 : 3 mm의 피루브산 : 2 mm의 95 % O 2로 버블 - 실온에서 5 % CO 2) 1 (RT, 25 ° C) - 4 시간, 동안염료가 전송되고있다. 버블 전체 잠복기 동안 용액. </li><li> 밤새 (O / N)을 포스트 - 고정 가능하도록 39 ° C에서 그들을 및 부화 (PFA / PBS 믹스 pH를 7. 약 100 ml)에이어서, PBS에 용해 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 brainstems 옮긴다. </li></ol> 5. 조직 슬라이스 및 장착 <ol><li> 다음날, PBS에 뇌간에게 (각 세척 단계 5 분) 세 번 씻어, 4 % 한천에서 그것을 커버하고 50로 절단 - vibratome에 80 μm의 두께 조각. 유리 슬라이드와 커버 슬립에 장착 매체를 이용하여 산 조각. </li><li> 선택적으로, (: AB 미디어 100 희석 1 예를 들어 파란색 Nissl) 25 분 동안 형광 Nissl와 섹션 레이블을 붙입니다. <ol><li> , AB 미디어를 준비 0.2 M 인산 완충액 250㎖를 혼합하는 방법 (PB; 51 mM의 KH 2 PO 4, 150 밀리미터 나 2 HPO 4), 15 ml의 5 M의 NaCl, 15 ml의 10 % 트리톤-X, 220 ML의 DDH 2 O 5g과 소 혈청 알부민. </li><li> Prece드를 PBS의 3 세척 단계로 Nissl 라벨 단계 (10 분마다)을 성공합니다. </li></ol></li></ol> 주 : 두꺼운 부분이 장착되고 분석 될 필요 경우 (예 : 여기에 기술 된 실험 슬라이스 100이었다 - 큰 거리에서 축삭 연결을 유지하기 위해 두께 500 미크론) 기술은 조직 지우기와 결합 될 수있다. 우리는 ClearT2 (12)가 20 성공을 발견했다. 조직 청소 단계가 포함되는 경우, 섹션을 설치하기 전에 수행합니다.

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Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>Zwicker, E., Fastl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Psychoacoustics Facts and Models. , (1990).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).</li><li>Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+induced+DNA+uptake+by+cells+is+a+fast+process+involving+DNA+electrophoresis.">Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis.</a> Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains.">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

, 생체 내 추적 연구에 반대 체외 추적 전기의 일반적인 강도는 고가의 정위 (종종 전기 생리학) 장비를 포함하지 않는, 그것은 연구자에게 따라서 관심과의 뇌 영역에 더 접근 할 수 있다는 것입니다. 덱스 트란 아민 및 다른 트레이서의 사용에 대한 상세한 검토를 참조 (생체 트레이서 주사의 경우가 아닌 일 또는 주 - 또한, 뇌 이식편 필요한 생존 기간은 몇 시간 (4 일)에 걸쳐...

특정 신경 (마이크로) 회로를 정의하기 위해, 상기 하나의 회로는, 자신의 접속 패턴의 다양한 참여자를 발견함으로써 시작한다. 이제까지의 lesioning 1을 통해 신경 해부학 추적 기술의 큰 다양성을 추적 neurofiber에 대한 월러의 게시가 설립되었습니다입니다. 1,971 5-6 발견으로 이들 기술 중 일부는 고정 된 조직 사후 2-4에 적용 할 수있는, 다른 라이브 뉴런 염료의 활성 전송에 의존한다. 후자는 또한 (주어진 돌기의 근원, 즉에 주입 영역으로부터. 면적 상기 돌출되는 뉴런 인 somata) 활성 역행 활용 방법을 구별 두 그룹으로 분할 될 수 있고, 활성 선행 성 (주입로를 주어진 투사의 대상, 즉. 축삭 돌기 및 레이블 뉴런) 수송의 축삭 터미널 지역. 또한, 어떤 경우에는 TRACER 재료는 다음 다른 경우에는 외식 뇌가 주입하는 동안, (생체 내 추적 주사에) 몇 일 또는 몇 주에 의해 주입을 생존과 인공 뇌척수액에 주입 후 몇 시간 동안 품어 살아있는 동물에 주입 (체외 추적 주사) . 이 프로토콜에서 우리는 생체 전기 기술 7-8에서 기존의 추적 물질로 choleratoxin 서브 유닛-B 및 테트라 메틸 덱스 트란을 이용하여 선행 성 및 역행 추적 실험에서 신경 세포 인 somata과 프로세스 레이블을 수정했습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 탐침 주사 중에 타겟팅 정확성을 향상시키기 위해 사용할 트랜스 제닉 마우스 선 및 기본적인 광학 기기를 이용하면서, 다른 뇌 핵 사이의 연결의 연결 패턴을 추적하는 효율적인 도구 신경 과학자를 제공하는 것이다. 선행 성 및 역 행성 추적의 방법을 사용하여 비록choleratoxin 및 덱스 트란 아민과 각각의 형광 표지 된 접합체는 9-13 새로운 것이 아니다 (예. 하스 등 전기의 방법 때문이다. 14), 뇌 조직의 블록을 포함하는 체외 준비에 전기와 추적 주사의 조합 보다 최근의 개발 7이다. 살아있는 동물에 추적 염료의 동일 유형을 사용하여 신경 세포의 추적 기술을 통해 그 주요 장점 때문에 일렉트로 염료 뉴런에 의해 흡수되고있는 더 높은 효율, 증가 된 표지의 강도이다. 실험자 주입 대상 영역 위에 시각적 컨트롤을 가지고 있기 때문에 추가적인 장점은, 트레이서 주입시 (염료 전송 요구)을 단축 잠복기 및 증가 된 정확성을 대상이다. 후자는 또한 고가의 장비가 정위 관심 핵 또는 뇌 영역을 찾기 위해 필요하지 않다는 것을 의미한다. ADDI으로레이 터는 우리는 405 nm의 파장과 일치하는 대역 통과 필터링 고글 휴대용 레이저 포인터 (450 이루어진 뉴런 (15)와 기본적인 광학 기기의 그 글라이신 개체군에서 GFP를 발현하는 트랜스 제닉 마우스 라인 이용했고, 정확도를 목표로 증가 - 700 ㎚). 따라서, 우리는 형광 신호를 통해 주입 영역을 식별함으로써 정확도를 타겟팅 및 토착 GFP 신호와 탐침 사이의 상호 작용의 관찰을 통해 주입 지역 내의 염료 확산을위한 제어 미세한 방법을 제공하여 상당한 추가적인 증가를 달성 형광. 우리의 기술은 추적 가득 차 있었다 (다른 마우스 라인 또는 흥분성)의 GFP 양성 억제 신경 세포를 식별하여 연결과 함께 회로의 기능을 발견 할 수 있습니다. 요약하면, 우리는 또한 척추 동물의 뇌의 커 넥톰을 공부하고 T를 평가하기 위해 강력한 신경 과학적 도구를 강화그는 주어진 neurocircuit의 다른 신경 해부학 적 특징. 저렴하고 널리 사용되는 광학 장비와 함께 형질 전환 마우스를 사용하여 우리는 크게 우리의 주사의 대상으로 정확도를 높일 수 있었다. 또한, 트랜스 제닉 마우스는 청각 뇌간에서 억제 저항기의 기능을 밝혀 도움 추적 접속의 타입을 식별하라고시켰다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td></td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate di-basic</td>
			<td></td>
			<td>S907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td></td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td></td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td></td>
			<td>A2153</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td></td>
			<td>X100</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td>
			<td></td>
			<td>P2139</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F84</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choleratoxin subunit-b</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C-34776 (Alexa 555)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-7162 (Alexa 555)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Nissl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479 (blue)</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbi-tal</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>Fatal-Plus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass filaments</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>G150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Zeitz Instruments, Germany</td>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion setup</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser pointer&#160;</td>
			<td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td>
			<td>HK-88007294 (405 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter/safety goggles</td>
			<td>Dragon Lasers, China</td>
			<td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bionocular microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td>Wild M3</td>
			<td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with installed MC Stimulus software</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel stimulator</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td>
			<td>STG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I., Israel</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

우리는 과정 중에 타겟 레이저 조명 및 매칭 필터 고글 뇌 절편에서 전기 천공을 통하여 염료 흡수를 증가시키기 위해 전기적 및 압력 펄스의 시리즈를 사용하여 시험 관내 트레이서 주입 프로토콜을 결합하는 기술을 제시한다. 그 자체로 체외 전기의 기술 기술은 뇌의 특정 지역을 타겟팅에 대한 상대적으로 좋은 시각 제어를 얻을 수 있습니다. 레이저 형광 유전자 마커의 자극과 판독 대역 통과 필터 고글을 통해, 유전자 표지 세포 / 핵 및 형광 추적 염료의 배출을 선택할 수있는 연구자가 실질적으로 주사의 정확도를 높일 수 있습니다과 결합하여 관심 영역을 발견하고 더욱 효율적으로 주입 영역에서 염료 확산 / 흡수를 위해 제어함으로써. 또한, 레이저 조사에 의한 방법은 잠 neurocircuit 소정의 기능을 연구 할 수 있도록GFP 발현이 신경 세포의 개체군에 의해 표현 송신기의 유형에 연결된 경우에 소정 영역에 돌출 뉴런의 유형에 대한 정보를 iding.

레이저 포인터 레이저 고글은 신속하고 저렴 쓰레기에서 GFP 양성 동물 유전자형 할 수있는 방법 1 및도 2를 도시한다. 어린 마우스 새끼의 경우, 기술은 비 침습적 두개골 상부 피부 (- D도 1a)를 통해 동물의 뇌에서 GFP 라벨을 식별하는 데 사용될 수있다. 방출 된 형광은 적어도 최대 3 일 산후 (도 1C)에 피부와 새끼 마우스의 두개골을 통해 알 수있다. 절차는 우...

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Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K 조회수.  University of Colorado School of Medicine.  우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다. 

비디오: Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

연구

신경과학

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

폐쇄 루프 신경 로봇 실험은 신경 네트워크의 전산 등록을 테스트하는

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...