우리는 패치 클램프 절차의 자동화를위한 개선에 유용한 조언을 길 라드 Silberberg 다음, 미셸 피나 텔리, 토마스 K. 버거, 루카 Gambazzi 및 소니아 가르시아에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 가치있는 조언과 소프트웨어 구현에 대한 지원은 Rajnish 란잔 감사합니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) 시냅스의 프로젝트에 의해 부분적으로 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 부분적으로 투자되었다.

1. 장비 준비 <ol><li> 컴퓨터에서 제어 조작기 <ol><li> 시리얼 포트 (RS-232)를 통해 컴퓨터에 각각의 미세 조작기 컨트롤러 박스를 연결합니다. </li><li> 쿼리 및 직렬 포트를 통해 전송 될 수 있도록 설정을 조정, 위치에 대한 명령을 구현합니다. 주어진 속도와 하드웨어 호환성 문제는 C / C + +는 프로그래밍 언어로 추천합니다. </li><li> 제로 모터 및 긍정적 인 움직임이 모터로부터 멀리 지향에 대하여 가장 근접한 위치가되도록 매니퓰레이터의 참조 시스템을 표준화한다. </li><li> 2mm 시편 초점면 (좌표 [0, 0, 2000]) 위의 중앙 위치에 현미경을 배치합니다. </li><li> 상점, 각 조작기 들어 피펫 팁이 현미경의 시야의 중심에서 관찰 될 수 있도록 로컬 좌표. 이것은 각 전극의 초기 기준점이다. </li></ol></li><li> 기기, 비즈니스LIZE 전극 포지션.이 실험 중에 각 전극의 위치를 추적 할 수 있어야하는 것은 매우 유용하다. 그래픽 표현이 달성의 가장 직관적 인 방법입니다. 이를 위해 기준 각 전극의 시스템과 현미경의는 일치해야합니다. 이를위한 간단한 방법이다 : <ol><li> 시야의 중심 전극의 선단을 가져온다. </li><li> 매니퓰레이터의 각 축의 위치 및 현미경 각축을 저장한다. </li><li> 매니퓰레이터 비교적 큰 운동 (1mm)의 x-축으로 실행한다. </li><li> 한 번 더 현미경의 이동 끝을 찾습니다. </li><li> 그것이 마지막으로 측정 한 이후 현미경 위치의 차이를 계산한다. 이러한 현미경 축 상 전극 축 이동의 돌출부이다. </li><li> Y 전극의 조작의 Z 축에 대한 2.5 - 반복 2.3 단계를 반복합니다. 이것은 현미경 상 돌기의 행렬 &lt;(결정 축을 허용강한&gt; 그림 2) 또한 코사인 매트릭스라고 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" /></li><li> 그것이 가능 좌표계 현미경에 지정된 위치에 도달하는 전극 매니퓰레이터에 필요한 입체적 움직임을 계산할 수 있도록이 행렬을 전환 : <img alt="식 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" /></li><li> 초기 기준점을 사용하고 코사인 행렬은 현미경의 각 전극의 위치를​​ 결정하는 코디네이터. </li><li> 현미경, 정기적으로 각 전극의 위치 좌표에 기초하여 그래픽 표시. 우리는 전극의 위치마다 40 밀리 초를 그리는 C / C + + 그리기 라이브러리 (GDI +)를 사용하기로 결정했습니다. </li><li> 1.2.7 수 밀리의 위치 변경이 필요한 경우 매니퓰레이터 각도가 변경되거나마다, 예를 들면, 전극의 종류가 변경 될 때 - 반복 1.2.1 단계. </li></ol></li><li> positio를 저장 가능이러한 세포 또는 해부학 적 기준점으로 조직의 관련 기능의 NS는 현미경으로 조정합니다. </li><li> 영상을 획득하고 관련 정보를 오버레이. <ol><li> 기계적 현미경 카메라의 수평축과 현미경의 움직임의 x-축 정렬. </li><li> 컴퓨터에 라이브 비디오 및 오버레이 기능 및 소프트웨어 개발 키트 (SDK)를 가진 프레임 그래버 설치. </li><li> SDK와 함께 라이브 비디오 디스플레이의 동작을 구현합니다. </li><li> 현미경은 적절한 번역 및 스케일링 카메라 레퍼런스 시스템에 좌표계 변환합니다. </li><li> 약 40 밀리 초 (그림 3)의 정기적 인 라이브 결과 이미지에 카메라 좌표와 오버레이에 관련 기능을 그립니다. </li></ol></li><li> 컨트롤 앰프. <ol><li> 인터페이스로부터 증폭기 설정을 제어하는​​ 증폭기 소프트웨어를 이용한다. </li></ol></li><li> 공동오실로스코프를 ntrol. <ol><li> 시리얼 포트를 사용하여 PC에 오실로스코프를 연결합니다. </li><li> 전압 클램프 패치 클램프 절차의 여러 단계의 오실로스코프 규모, 커플 링 및 시간 해상도를 확인합니다 (예 : 전극 목욕, 인감 형성, 전체 셀 구성) 및 전류 클램프. </li><li> 앰프의 명령이 인터페이스에서 업데이트 될 때마다 적절한 오실로스코프 설정 명령을 보냅니다. </li></ol></li><li> 제어 피펫 압력. <ol><li> 도 4에 따른 압력 제어 장치를 조립한다. <ol><li> 적절 각 전자 부품을 공급하는 12 V / 5 V 전원을 사용한다. </li><li> 양압 버퍼 (100 ㎖ 용기) 한 막 펌프의 출력을 연결한다. </li><li> 음압 버퍼 (100 ㎖ 용기)에 하나의 막 펌프의 입구를 연결합니다. </li><li> pressu의 압력 센서에 피펫 홀더 튜브를 연결합니다제어 시스템 및 메인 압력 실에 연결되어 공압 밸브를 재. </li><li> 메인 압력 실에 연결된 밸브에 압력 각 버퍼를 연결합니다. </li><li> 메인 압력 구획과 대기 사이에 밸브를 연결합니다. </li><li> 메인 압력 실에 압력 센서를 연결합니다. </li><li> 각 버퍼에 압력 센서를 연결합니다. </li><li> 데이터 수집 보드에 압력 제어 시스템을 연결한다. </li><li> 하나의 아날로그 입력으로 각 압력 센서를 연결합니다. </li><li> 디지털 출력에 각 밸브를 연결합니다. </li></ol></li><li> 막 펌프에 연결을 제외한 모든 밸브를 열고 측정 된 압력을 뺀 모든 센서로부터의 오프셋 (offset) 대기의 압력을 제거합니다. </li><li> 압력 제어를 구현 <ol><li> 인터페이스의 각 피펫에 대한 긍정적 인 압력 제어를 활성화 또는 비 활성화시킬 수있는 컨트롤을 정의합니다. </li><li> 피펫에 대한 최소한의 긍정적 인 압력을 정의약 70 밀리바의의. </li><li> 활성 압력 제어하에 피펫의 압력이 설정 임계 값 아래로 떨어질 때마다 주기적으로 (매 0.5 초)을 검출한다. </li><li> 임계 값 초과시 피펫의 압력이 임계 값을 초과 할 때까지 짧은 기간 (20 밀리 초) 동안 문제의 피펫으로 메인 압력 실이 구획에 긍정적 인 압력 버퍼를 엽니 다. 다른 모든 밸브를 닫습니다. </li><li> 그 셀을 향한 최종 접근을 시작으로 더 압력 제어를 드 활성화. </li></ol></li><li> 씰 형성에 부정적인 압력을가 <ol><li> 모든 밸브를 닫고 실험을 누르면 버튼을 유지하여 필요로하는 시간에 대한 질문에 피펫으로 메인 압력 실이 구획을 향해 부정적인 압력 버퍼 밸브를 엽니 다. </li></ol></li></ol></li><li> 휴먼 인터페이스 장치에 명령을 중앙 집중화. <ol><li> 시판 wirele 연결PC에 SS 게임 패드. </li><li> 조이스틱 상태의 판독을 구현합니다. 예를 들어, 판독마다 5 밀리 초를 수행하는 C / C + +에 대한 다이렉트 라이브러리를 사용합니다. </li><li> 버튼은 마지막 단계 이후, 프레스 릴리스 또는 계속 누르고 된 어느를 감지하는 이전 상태와 현재 상태를 비교합니다. </li><li> 게임 패드의 각 버튼에 기능을 할당합니다. 이 매핑의 예는도 5에 도시된다. </li></ol></li></ol> 2. 패치 클램프 절차 <ol><li> 관심 영역의 뇌 조각을 준비합니다. </li><li> 현미경의 변위 범위의 중앙에있는 관심 영역으로 관심의 뇌 조각을 놓습니다. </li><li> 셀 선택 <ol><li> 현미경으로 탐색하여 그 세포를 식별합니다. 좌표계를 현미경에 따라 세포의 위치를​​ 저장 바로 그 셀의 상단에 라이브 비디오 화면에 마우스를 클릭합니다. </li&gt; <li> 이미지에 중첩 될 셀 위치에 마커를 추가 할 그래픽 인터페이스는 글로벌 개요와 소프트웨어를 선택한 셀뿐만 아니라 마이크로 피펫을 표시합니다. 또한 셀의 이미지는 파일 &#39;셀 #. JPG&#39;에서 향후 참조를 위해 캡처됩니다. </li></ol></li><li> 피펫으로 세포의 속성 <ol><li> 관심의 셀을 선택 한 후, 각 셀을 기록 할 피펫 할당합니다. 그래픽 인터페이스를 설정해야 할당 컨트롤을 제공합니다. 확인란 &#39;쇼 최종 위치&#39;를 선택하여 최종 구성의 미리보기를 시각화. </li><li> 최종 위치 미리보기가 원하는 또는 &#39;전체 선택&#39;을 체크 박스에 체크되는 각각의 펫을 선택합니다. 필요한 경우 더 나은 시각화를 위해 현재의 위치 표시를 사용하지 않도록 설정합니다. </li></ol></li><li> 피펫을 준비 <ol><li> (- 많은 피펫을 사용하는 경우 8 MΩ 일반적으로 최고 6) 위스콘신 피펫 채우기세포 내 솔루션을 토륨 및 그 소유자에로드. 자신의 고착에 headstages을 배치하지만, 피펫 팁으로 화장실에 손이 닿지 않도록 앞으로 그들을 밀어하지 않습니다. </li><li> 긍정적 인 압력 제어를 가능하게하고 끝은 깨끗한 남아 있는지 확인하기 위해 모든 피펫을 선택합니다. 조심스럽게 제자리에 각 headstage를 밀어 넣습니다. </li></ol></li><li> 피펫 팁을 찾기 <ol><li> 3mm &#39;A&#39;버튼을 누른 채 버튼 R2를 눌러 조각 위의 초점을 중앙 위치로 현미경을 배치합니다. 버튼 L2를 눌러 이전 실험에서 저장된 A 버튼을 누른 상태에서 각 조작에 대한 해당 위치를 사용 참고 : 대부분의 경우에서 관찰하기에 충분해야한다이 때보기에서 피펫의 독특한 그림자 또는 피펫의 축을 따라 작은 움직임 하나가 있어야합니다. 피펫 모양에 약간의 차이에 대한 보상은 수동으로 수행해야합니다. </li><li> 초점에 피펫 팁을 가져와. (아직 [0, 0 2000] 위치에 있어야합니다) 현미경을 이동하지 않고 비디오 디스플레이의 빨간색 중앙 점에 끝을 놓으십시오. </li><li> 피펫 각 피펫 팁이있는 후 버튼 C를 누른 상태에서 버튼 Z를 눌러 디스플레이의 중심에 소프트웨어를 알려, 거꾸로 그 피펫을 보낼 수 있도록 단추 A를 누른 상태에서 하나의 버튼 L1을 눌러 찾을 수 있습니다 다음 </li></ol></li><li> 세포 접근 <ol><li> 모든 피펫 팁을 정밀하게 위치 된 각각의 피펫이 세포에 기인하면, 자동으로 각 셀에 가까운 피펫을 배치합니다. 단순히 세포의 그룹의 중심을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 팝업 메뉴에서 옵션을 &#39;클러스터&#39;를 선택합니다. , 표시이 시간에 위치 할 모든 피펫을 선택하고 &#39;모두 선택 피펫으로 이동&#39;을 클릭합니다 클러스터 옵션 창에서. 그 세포의 각 클러스터에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> PE수동으로 최종 접근을 rform. 세포를 기준으로 피펫의 위치를​​ 다르게 지정하지만, 일반적으로 200 ㎛ 떨어져 조직 외부 피펫의 선단을 유지하는 충분한 수직 방향 피펫 및 그 위에 200 ㎛의 축에서 셀로부터 단순히 수 . 피펫의 위치가 완료 될 때까지 기다렸다가 버튼 C를 누른 상태에서 버튼 R1을 누르면 피펫으로 현미경 이동 </li><li> 비디오 디스플레이의 아무 곳이나 그 끝에 현미경을 집중하고 버튼 C.에게 사각형 격자를 누른 상태에서 B 버튼을 눌러 각 피펫의 위치를​​ 재 보정하면 간단히 피펫의 식별 된 위치를 나타내는 표시됩니다. 위치가 정확하지 않으면 버튼 C를 유지하면서, 비디오 디스플레이와 버튼을 누르면 Z의 중앙 점에 팁의 위치를 </li></ol></li><li> 세포 부착 된 구성을 설정 <ol><li> 현재 피펫에 대한 관심의 세포가 제대로 있는지 확인표시. 그렇지 않으면 중앙 빨간 점과 함께 관심의 세포에 맞게 현미경을 이동합니다. 마크 피펫 거리에 할당 된 셀에서 200 ㎛의 위치를​​ C 버튼을 누른 상태에서 버튼을 눌러 C. L2 버튼을 누른 상태에서 버튼 Y를 눌러 셀, 현미경은 자동으로 해당 위치로 이동합니다. </li><li> 이 빨간 점을 일치하도록 피펫의 위치를​​ 조정합니다. 버튼 X를 누른 상태에서 버튼 R1을 눌러 오프셋 피펫을 조정 </li><li> 천천히 기인 셀에 피펫 접근 버튼 X를 누른 상태에서 버튼을 L1을 눌러 테스트 펄스를 활성화합니다. </li><li> 세포막의 표면에 딤플의 형성을 관찰시인가 압력이 셀에 도달 할 수 있도록 버튼 Z 채 Y 버튼을 누름으로써 부압의 짧은 펄스를 적용한다. 약-65mV의 유지 가능성이 버튼 X를 누른 상태에서 버튼 L2를 눌러이 시점에서 설립한다 </li></ol></li><li> 전체 - 세포 구성<ol><li> 기가 시일은 각 셀에 대해 형성되면, 부압을인가함으로써 세포막을 파열 시작. </li></ol></li><li> 녹음을 수행 <ol><li> 당신의 레코딩을 수행하는 자극 / 수집 시스템을 사용합니다. 한 번에 펄스 또는 하나의 개별 셀에 펄스의 기차를 적용하고 기록 세포 사이의 연결을 매핑하는 나머지 셀에 반응을 관찰합니다. </li></ol></li><li> 피펫을 떼다 <ol><li> 녹음이 완료되면, 테이블 라디오 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 조직에서 서서히 피펫을 떼다. 피펫은 자신의 축을 따라 짧은 거리를 후퇴 가지고 &#39;을 떼 -&gt; 피펫 500 μm의&#39;를 선택합니다. (몇 가지 긍정적 인 압력을 적용하여 조언을 취소 도움이 될 수 있습니다) 세포의 잠재력 드리프트를 관찰합니다. </li><li> 모든 방법을 다시 피펫을 떼다, &#39;빠른&#39;에 위치 결정 속도를 설정하고 같은 작업을 반복하지만, &#39;모든&#39;옵션을 선택합니다. 사용을 제거부드럽게 headstages을 슬라이딩 홀더에서 피펫을 풀면 피펫. 그것은이 크게 피펫 팁의 위치를​​ 방해 할 수 있기 때문에 해당 소켓에 홀더를 왜곡되는 것을 방지하는 데 유용합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

즉각적인 문제는 우리가 일반적으로 기술 된 과정 성공률 관한 생긴다. 높은 성공률에 대한 준비는 필수적이다. 피펫은 기록 된 세포의 존재에 대한 적절 팁 구멍이 있어야합니다. 막힌 피펫을 피하기 위해 세포 내 액을 여과하는 것도 중요하다. 매우 깨끗하고, 갓 뽑아 피펫은 다른 요구 사항입니다. 이항 분포는 이러한 문제를 최종 수율에 영향을 미치는 방법을 이해하는 데 사용할 수있는 간단?...

마이크로 미터 정밀도로 다수의 사이트를 기록하고 자극하는 능력은 실험적 신경 시스템의 더 나은 이해를 달성하기 위해 매우 유용하다. 대부분의 기술은이를 위해 개발되었습니다 만, 어느 것도 submillivolt 해상도가 서브 스레숄드 활동 및 개별 시냅스 잠재력을 공부에 필수적인 패치 클램프 기술에 의해 달성 할 수 없습니다. 여기에서 우리는 동시에 녹음하고 신경원 연결성의 연구를위한 충분한 정밀도로 각 셀을 다수 자극 겨냥 열두 전극 컴퓨터 보조 패치 - 클램프 시스템의 개발을 포함한다. 많은 다른 애플리케이션이 같은 시스템에 대해 생각 될 수 있지만, 뉴런의 그룹 내에서 가능한 연결의 수가 문제 뉴런의 수의 제곱에 비례하여 성장한다는 관련 시냅스 연결의 연구에 특히 잘 빌려 준다. 따라서, 세 개의 전극 시스템에게 테스트 수 있지만최대 6 개의 연결의 발생과 가장 자주 열두 뉴런을 기록, 단일 한 기록은 최대 132 연결의 발생을 테스트하고 자주 (그림 1) 하나 이상의 다스을 관찰 할 수 있습니다. 연결 수십 동시에 관측 가능 소규모 네트워크의 구성을 분석하고, 그렇지 않으면 1 프로빙 할 수없는 네트워크 구조의 통계적 성질을 유추 ​​할 수있다. 또한, 수많은 세포의 정확한 자극은 시냅스 후 세포 2 모집의 정량화 할 수 있습니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

패치 클램프 기술은 개별 신경 세포 또는 세포 내 구획에서 전기 활동을 기록하기위한 가장 잘 확립 된 방법 오늘입니다. 그럼에도 불구하고, 안정된 기록을 실현에도 개별 세포에서 상당한 복잡도의 시간 소모적 인 절차 남아있다. 효율적인 정보 표시와 함께 여러 단계의 자동화가 크게 더 큰 신뢰성과 녹음의 큰 숫자를 수행하는 적은 시간 experimentalists 에의을 지원할 수 있습니다. 대규모 기록을 달성하기 위하여, 우리는 가장 효과적인 접근법은 완전히 공정을 자동화하기 위하여 만 실험 단계를 단순화하고 효율적 실험자의 경험 및 비주얼 피드백을 도입하면서 인간의 오류의 가능성을 줄일 수없는 결론 지었다. 이러한 목표를 마음에 담아두고, 우리는 하나의 인터페이스에서 다중 전극 패치 클램프 실험, COMMERC에 필요한 모든 컨트롤을 중앙 집중식으로 컴퓨터를 이용한 시스템을 개발ially 사용할 수있는 무선 게임 패드, 컴퓨터 화면에 실험 관련 정보 및 안내 신호를 표시하는 동안. 여기에서 우리는 우리가 기록 구성을 달성하기 위해 필요한 시간을 감소시키고 실질적으로 동시에 성공적 뉴런 다수의 기록 가능성을 높일 수 시스템의 다른 구성 요소를 설명한다.

상술의 방법으로 우리는 다음 거의 동시에 신경 세포의 큰 숫자 패치 클램프 따라서 작게 배로 동시에 최대 열두 뉴런의 전체 - 세포의 기록을 행하는 것에 성공. 쥐의 체 감각 피질의 레이어 V에 기록 된 피라미드 뉴런 사이의 직접 시냅스 연결의 네트워크의 예는 그림 6에 나와 있습니다. 주어진 세포 유형에 대한 간 체세포의 거리의 함수로서 접속 확률 정보의 ...

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A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

다중 전극 패치 클램프 녹음은 복잡한 작업을 구성한다. 여기에서 우리는 실험 단계의 많은 자동화함으로써, 성능과 녹음 수의 질적 향상으로 이어지는 프로세스를 가속화 할 수 방법을 보여줍니다.

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K 조회수.  Ecole Polytechnique Federale de Lausanne.  다중 전극 패치 클램프 녹음은 복잡한 작업을 구성한다. 여기에서 우리는 실험 단계의 많은 자동화함으로써, 성능과 녹음 수의 질적 향상으로 이어지는 프로세스를 가속화 할 수 방법을 보여줍니다. 

비디오: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
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Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subSubmitochondrial 소포 막 패치 클램프 녹음을 공연&gt; ATPase의 소포의 준비와 기술

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

의 감각 뉴런의 분리<em&gt; 군소 californica</em&gt; 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.