당사의 프로토콜은 세포 배양에서 직접 microRNA 생물 발생 및 성숙에 대한 조절 RNA 결합 단백질의 영향을 다룹니다. 우리가 설명하는 방법은 일반적인 세포 배양 시약으로 수행 할 수 있으며 비교적 빠릅니다. 이 방법은 다양한 유형의 진핵 세포에서 microRNA와 그 표적의 표현형 효과를 연구하는 데 중요 할 수 있습니다.
정상 또는 질병-유사 세포가 사용될 수 있다. 루시퍼라제 활성을 통한 표적 친화도의 변화를 관찰하기 위해 형질감염에 적합한 세포주를 선택하고, 적절한 형질감염 및 유도 조절을 수행하는 것이 중요하다. 시작하려면 DMEM, 100mm 페트리 접시에 고혈당 보충제로 세포를 유지하고 5%이산화탄소가 있는 가습되고 제어된 분위기 인큐베이터에서 섭씨 37도의 세포를 배양합니다.
부착 세포를 분리하려면 트립신 -EDTA 용액과 함께 섭씨 37도에서 3-5 분 동안 배양하십시오. 형질주입을 수행하려면 100 마이크로리터의 배양 배지에 200 나노그램의 DNA와 1.25 마이크로리터의 형질주입 시약을 혼합하고 형질주입 혼합물을 세포에 첨가합니다. 이어서, 세포를 형질주입 혼합물과 함께 섭씨 37도에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
그런 다음 배지를 10%FBS를 포함하는 배지로 교체하고 선택을 위해 항생제를 추가하기 전에 24시간 더 배양합니다. pFLAG-HuR 및 MT-pFLAG를 HeLa로 형질감염시키려면 Geneticin의 농도를 밀리리터당 100마이크로그램에서 밀리리터당 1000마이크로그램으로 증가시켜 세포를 선택하여 안정적인 세포주를 생성합니다. 그 후, HuR mRNA에 특이적인 프라이머를 이용한 정량적 PCR로 과발현을 확인하였다.
HeLa-Cre 세포의 플라스미드를 40 나노그램 pTK-Renilla로 형질감염시킨 다음 pRD miR 17-92로 형질감염시켜 HeLa-Cre miR 17-92를 생성하고 1밀리리터당 1마이크로그램 퓨로마이신으로 선택합니다. 이어서, HeLa-Cre miR 17-92를 pTK-Renilla 및 pmirGLO RAB1B 3'UTR 또는 pmirGLO를 별도로 스크램블링하여 1B 3'UTR로 형질감염시킨다. 다음으로, 페니실린 및 스트렙토마이신을 사용하여 선택하여, luc RAB1B 및 luc 스크램블의 생성을 초래한다.
다음으로, 이전에 시연된 대로 pFLAG-HuR 또는 MT-PFLAG로 세포를 형질감염시킵니다. 약 80%의 컨플루언시에 도달할 때까지 HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 스크램블, HeLa-Cre miR 17-92 HuR 및 HeLa-Cre miR 1792 HuR 잠금을 사용하여 세포 배양을 진행합니다. 이어서, 섭씨 37도에서 30분 동안 1 마이크로리터의 독시사이클린을 유도하고, 또한 독시사이클린이 없는 모든 세포를 대조군으로 동일한 기간 동안 유지한다.
다양한 발광 강도를 정량화하고 비교하려면 이중 루시퍼라아제 리포터 분석 키트를 사용하십시오. 분석을 시작하기 전에 루시페라아제 분석 용액을 해동하고 실온에 두십시오. 다음에, 10 밀리리터의 루시퍼라아제 분석 완충액 2에 200 마이크로리터의 기질을 혼합함으로써 Stop 및 Glo 믹스를 준비한다.
그런 다음 10 밀리리터의 루시퍼라아제 분석 완충액 2를 루시퍼라아제 분석 기질 2의 호박색에 넣고 혼합하고, LAR II를 혼합하고, 잘 흔들어 준다. 그런 다음 용액을 이전에 식별되고 빛으로부터 보호되는 15 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, Synergy와 같은 장비를 사용하여 발광 판독을 수행하고 표현된 루시페라아제를 상대 조명 단위로 측정한 다음 추가 통계 분석을 위해 결과를 스프레드시트로 내보냅니다.
대조군 Renilla에 의해 반딧불이 루시퍼라아제 활성의 정규화를 수행하고 독시사이클린 유도가 있거나 없는 그룹에 대해 반복하면서 그래픽에 상대적 조명 단위로 플롯합니다. HeLa, BCPAP 및 HEK293T 세포주에서 pFLAG-HuR의 형질감염시 HuR의 과발현이 확인되었으며, 이들 세포에서 HuR 과발현이 miR19A의 발현을 자극하는 것으로 관찰되었다. HeLa-Cre 세포와 비교하여 pRD miR 17-92로부터의 miR19A 및 miR19B 발현 증가시 RAB1B 3'UTR에서 루시퍼라아제 활성의 강한 감소가 관찰되었다.
HeLa 세포에서 pFLAG-HuR의 형질감염은 루시퍼라아제 활성을 변화시키지 않았다. 그러나, HuR의 과발현은 독시사이클린 보충과 함께 miR 17-92 클러스터의 발현을 자극하여 루시퍼라아제 활성을 더욱 감소시켰다. microRNA 성숙에서 RNA 결합 단백질의 역할을 확인한 후 세포 역학 및 세포주기 분석은 microRNA에서 단백질에 의해 촉진되는 주요 변화를 이해하는 데 중요합니다.
