글로벌 크로마틴 역학은 암 및 노화와 같은 여러 질병 상태의 중요한 매개자인 것으로 나타났습니다. 우리의 프로토콜은이 과정을 연구하기위한 생리 학적 관련 모델을 제공합니다. 히스톤 번역 후 변형 또는 PTMS의 표준 실험실 분석은 일반적으로 항체 기반 분석을 사용하여 한 번에 단일 PTM에 대한 프로빙으로 제한됩니다.
히스톤 PTMS의 액체 크로마토그래피 질량 분광법 분석을 통해 단일 실험에서 수백 개의 PTMS의 풍부함을 측정 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Stephanie Stransky, Ronald Cutler, Julie Kim, postdoc, grad student 및 Research Tech가 각각 실험실에서 나올 것입니다. 첫째, 표준 성장 배지를 사용하여 세포가 80 % 합류 할 때까지 단층으로 성장시킵니다.
그런 다음 HBSS로 세포를 세척하십시오. HBSS에 희석 된 0.05 % 트립신 - EDTA 5 밀리리터를 넣으십시오. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 5분 동안 배양한다.
현미경을 사용하여 세포 분리를 확인하십시오. 세포를 계수한 후, 세포 현탁액을 신선한 성장 배지로 희석한다. 0.5 밀리리터의 성장 배지를 추가하여 초저 부착물 24 웰 둥근 바닥 플레이트와 각각 여러 개의 마이크로 웰을 평형화하십시오.
그런 다음 플레이트를 3000 x g로 원심분리하여 플레이트의 표면에서 기포를 제거한다. 이제 이전에 만들어진 세포 현탁액을 24-웰 플레이트로 옮기고 120 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 24-웰 플레이트에서 세포를 확인한 다음, 스페로이드 형성을 위해 24시간 동안 5% 이산화탄소로 플레이트를 섭씨 37도에서 인큐베이션한다.
한편, 생물 반응기를 평형화하기 위해 25 밀리리터의 멸균수를 습도 챔버에 첨가하고 아홉 밀리리터의 성장 배지를 세포 챔버에 첨가하십시오. 생물반응기를 회전하는 클리노스타트 인큐베이터에서 5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양한다. 초저 부착 24-웰 플레이트에서 구상체를 분리하여 밀리리터 너비의 보어 팁 하나를 사용하여 부드럽게 피펫팅하고, 이를 조직 배양 접시로 옮깁니다.
구상체 형태를 충분히 선택하려면 현미경으로 구상체의 품질을 확인하십시오. 좋은 품질의 구상체는 균일 한 크기, 컴팩트 함 및 원형도를 가지고 있습니다. 평형 생물 반응기에 다섯 밀리리터의 신선한 성장 배지를 채우고 구상체를 그 안으로 옮깁니다.
그런 다음 생물반응기를 신선한 성장 배지로 완전히 채우고 생물반응기를 클리노스타트 인큐베이터에 넣고 10 내지 11 RPM으로 한다. 이틀에서 사흘에 한 번씩 10밀리리터의 오래된 미디어를 신선한 미디어로 대체하여 성장 미디어를 교환합니다. 이 구상체의 크기와 수가 증가함에 따라 인큐베이터의 회전 속도가 증가합니다.
스페로이드 펠렛을 얻은 후, 펠릿과 피펫에 다섯 부피의 차가운 0.2 몰 황산을 위아래로 첨가하여 펠렛을 파괴하고 히스톤을 방출하십시오. 원심분리 후 상층액이 얻어지면 차가운 농축 트리클로로 아세트산을 첨가하여 최종 농도가 25 ~ 30 % 부피 %가되도록하십시오. 그리고 원고에 기재된 바와 같이 튜브를 몇 번 반전시키고 원심분리하여 혼합한다.
상층액을 버린 후, 유리 목초지 피펫을 사용하여, 펠릿과 튜브의 벽을 약 500 마이크로리터의 차가운 아세톤과 0.1% 염산으로 세척한 다음, 섭씨 4도에서 5분 동안 3, 400 x g에서 원심분리한다. 그런 다음 튜브를 뒤집어 상층액을 버립니다. 유리 목초지 피펫을 사용하여 500 마이크로 리터의 100 % 차가운 아세톤을 첨가하여 이전에 입증 된 바와 같이 펠렛과 원심 분리기를 세척하십시오.
상층액을 버린 후, 조심스럽게 피펫팅하여 아세톤을 완전히 제거하고, 샘플을 열린 뚜껑으로 약 20분 동안 건조시킨다. 펠렛을 pH 8의 100 밀리몰 암모늄 중탄산염에서 15 내지 20%의 아세토니트릴의 20 마이크로리터에 재현탁시킨다. 볼텍싱 후, 현탁액을 1000 x g에서 30초 동안 스핀다운시킨다.
여덟 개 이상의 샘플의 경우, 각각의 재현탁된 샘플을 96-웰 플레이트로 옮긴다. 그런 다음 후드에 두 마이크로 리터의 프로피온성 무수물을 넣고 다섯 번 피펫팅하여 혼합하십시오. 수산화 암모늄 10 마이크로 리터를 신속하게 넣고 다섯 번 피펫팅하여 혼합하십시오.
HLB 수지를 마그네틱 교반 플레이트에 섞는다. 그런 다음 70 마이크로리터의 HLB 현탁액을 96-웰 수집 플레이트 상의 96-웰 필터 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 유동을 폐기한 후, 수지를 0.1%트리플루오로아세트산 100 마이크로리터로 세척한다.
각 샘플을 0.1% 트리플루오로아세트산 100마이크로리터에 재현탁시킨 후 각 샘플을 각 웰에 넣고 진공을 사용하여 튀는 것을 방지합니다. 유동을 폐기한 후, 샘플을 100 마이크로리터의 0.1%트리플루오로아세트산으로 세척하고, 필터 플레이트를 새로운 수집 플레이트 상에 놓는다. 다음으로, 0.1 % 트리플루오로 아세트산에 60 마이크로 리터의 60 % 아세토 니트릴을 각 웰에 넣고 진공을 사용하여 튀는 것을 방지하십시오.
통과된 흐름을 수집하고 속도 진공에서 건조시킨다. 건조 된 수집 플레이트를 HPLC에로드하고 원고에 설명 된대로 LC / MS / MS 방법을 실행하십시오. 이 연구에서, 일반적인 히스톤 번역 후 변형의 상대적 풍부도는 3차원 구상체로서 성장한 C3A 간세포에서 관찰되었다.
번역 후 변형은 또한 히스톤 단백질로부터 생성된 펩티드의 단일 잔기에서 관찰될 수 있었다. 구상체를 나트륨 부티레이트로 처리하면 히스톤 아세틸화의 상대적 풍부도가 증가한 반면, 숙시네이트 나트륨을 사용하면 히스톤 잔기가 숙시닐화되었습니다. 이 방법은 또한 나트륨 부티레이트 처리 후 히스톤 아세틸화의 분포 패턴과 숙시네이트 나트륨으로 처리 한 후 히스톤 숙시닐화의 분포 패턴을 입증했다.
결과는 또한 다른 히스톤 변형의 공통 패턴을 보여주었습니다. 소듐 부티레이트 처리는 히스톤 단백질 H3로부터 생성된 펩티드 상의 리신 잔기 14의 아세틸화를 상당히 향상시켰는데, 이는 그의 아홉 번째 라이신 잔기가 두 개의 메틸기를 가졌으나 하나 또는 세 개의 메틸기가 없는 경우에만 그러했다. H3 유래 펩티드에서의 개별 변형 및 번역 후 변형의 다양한 조합의 상대적 풍부도가 또한 계산되었다.
소듐 부티레이트 처리 후 번역 후 변형의 조합 패턴은 히스톤 단백질 H4로부터 생성된 펩티드에서도 관찰되었다. 여기에서도, 나트륨 부티레이트 처리는 아세틸화의 현저한 증가를 가져왔다. 시료 유출을 피하기 위해 구상체를 가능한 한 적게 벤치에 보관하고 탈염 단계에서 구상체를 유지하는 데 중요한주의를 기울여야합니다. 이 워크 플로우는 평평한 세포 배양을 빠르게 복제하는 것보다 더 생리적 인 모델을 사용하여 고체 조직에서 크로마틴을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다.
