JB는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 박사 과정 학생, SR 연구소는 CRUK 수석 연구 활동 (C99667/A12918)에 의해 투자되는 바와 같이, CRUK 임상 동료입니다. 이 작품은 두 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 전략 포상 (097945/B/11/Z 및 095931/Z/11/Z)에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 및 치료 <ol><li> 문화 인간 골육종 (U2OS) 세포에 표 1에 열거 된 시약 및 장비를 수집합니다. 모든 시약을 제조하고 무균 수 있도록 층류 공기 유동 후드에서 모든 조직 배양 기술을 실시 </li><li> 다음과 같이 문화 매체를 준비 : 10 % (FCS)의 최종 농도를 달성하기 위해 DMEM에 50 ㎖의 FCS, 5 ㎖의 L-글루타민 및 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가, 2 개 mm (L-글루타민), 50 U / ㎖ ( 페니실린) 50 U / ㎖ (스트렙토 마이신). 물을 욕조에 37 ° C에서 배양 배지를 따뜻하게. </li><li> 치료를위한 세포를 준비 <ol><li> 70 % 에탄올에 몇 가지의 coverslips를 소독, 6 개의 3.5 cm 플레이트의 하단에 하나를 공기 건조하고 배치 할 수 있습니다. </li><li> 2 ㎖의 커버 슬립들이 우물의 바닥에 부착하게 유지하려면 커버 슬립 집게로 아래로 눌러, 전체 DMEM (37 ° C)를 따뜻하게 담가. </li><li> 자신의 조직 숭배에서 U2OS 세포를 분리4 ML을 적용, 3 ㎖의 PBS로 한번 세척하여 우레 판은 0.05 % 트립신-EDTA (1 %)을 따뜻하게하고 7 분 동안 37 ° C에서 배양. </li><li> 6 ㎖에 재현 탁 세포는 트립신-EDTA를 불 활성화 및 혈구를 사용하여 계산하는 완전한 DMEM을 따뜻하게. </li><li> 1.3.1 점에서 제조 된 3.5 cm 플레이트의 각 플레이트 2 × 10 5 세포. 부드럽게도 셀 분포를 확인하기 위해 판 바위. 세포가 치료 전에 하룻밤을 준수 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 저산소증의 워크 스테이션에 4 개의 3.5 cm 플레이트를 배치하여 세포를 치료하고 정상 산소 조건에서 37 ° C에서 인큐베이터에있는 다른 2 개의 3.5 cm 판을 둡니다. 저산소증의 치료가 끝나기 전에 (저산소증 처리 된 세포의 저산소 챔버에서) 처리 조건에서 RNA 라벨링 분석 1 시간을 개시 할 준비가. </li><li> 1 시간 15 분, 1 시간 30 분, 2 시간, 24 시간 동안 저산소 세포를 노출합니다. 이 시점은 유연하고 사용자가 결정됩니다. </li><li> normo를 사용양성 대조군과 음성 대조군으로 4 시간 동안 티노 마이신 D (10 ㎍ / ㎖의 최종 농도)로 처리 정상 산소 3.5 cm 플레이트로 XIC 3.5 cm 플레이트. 악 티노 마이신 D 글로벌 RNA 합성의 억제입니다. </li></ol> 주의 사항 : 훽스트 33342 알려진 돌연변이입니다. DMSO는 조직으로 유기 분자의 진입을 용이하게하는 것으로 알려져있다. 수산화 나트륨은 부식성이. 염산은 부식성이. 파라 포름 알데히드는 모든 동물에 매우 독성과 인간의 죽음의 원인이 될 수 있습니다. 트리톤 (Triton) X-100은 직접 접촉 다음의 경우 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 악 티노 마이신 D 때 피부 나 섭취와 접촉 독성이다. 모든 유해 화학 물질을 취급 할 때 적절한주의하십시오. 2. 클릭 - IT 분석보기 <ol><li> - 7.6, PBS 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 1 % 트리톤 X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) pH를 7.2 : 클릭 - IT 분석 키트 외에 필요한 다음과 같은 시약을 수집PBS에서 -100, 탈 이온수 DH (2 O), 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 10 M 수산화 나트륨 (NaOH) 및 37 %의 염산 (HCL); 옵션 - 산도 표시기 스트립. </li><li> 다음과 같이 클릭-IT 반응을 수행하기 전에 신선한 PFA 주식 솔루션을 준비 : <ol><li> 1.85 g PFA, 50 ML 팔콘 튜브에 3.5 ㎖의 dH보다 2 O 및 M NaOH를 of10 10 μl를 넣어. 물 목욕을하고 흄 후드에서이 서 전자 레인지에 큰 비커에 H 2 O 400 ㎖ - 300 끓인다. </li><li> 물을 욕조에 50 ㎖의 송골매를 놓고 부드럽게 PFA가 용해 될 때까지 주기적으로 뚜껑을 발표, 10 분 동안 교반한다. </li><li> 37 % 용액의 결과로, 또 다른 50 ㎖의 팔콘 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 PFA 용액을 주사기. </li><li> PBS를 추가하여 10 배 희석하고 진한 염산 12 μL에 대한 추가하여 6.8으로 산도를 가져옵니다. 옵션 : 흄 후드의 표시 스트립 정확한 산도를 확인합니다. </li><li> 즉시 사용 또는 o 저장vernight에서 4 ° C. </li></ol></li><li> 다음과 같이 RNA 이미징 키트의 주식 솔루션을 준비 : <ol><li> 유럽 ​​연합 (EU)의 100 mm의 원액의 결과 구성 요소에 373 ㎕의 Dh를 2 O를 추가합니다. 최대 1 개월 -20 ° C에서 보관. </li><li> 구성 요소 B (알렉사 플 루어 594)에 DMSO의 85 μl를 추가하고 피펫 또는 소용돌이로 교반하여 혼합한다. 최대 1 년 -20 ° C에 모두 저장합니다. </li><li> RNA 이미징 키트 반응 버퍼 첨가제의 10X 솔루션을 만들 구성 요소 E에 2 ㎖ dH보다 2 O를 추가합니다. 솔루션은 브라운 색상을 개발하는 경우 최대 1 년 -20 ° C에서 보관은 버린다. </li></ol></li><li> 유럽 ​​연합 (EU)과 세포의 레이블 : 데워진 완전 배지 (37 ° C)에서 2.3 단계에서 제조 된 100 밀리미터 재고 EU의 2 배 작업 솔루션을 준비합니다이 단계의 나머지 부분을 수행하고 저산소증으로 처리 된 세포의 저산소 챔버에서 2.5 단계. . 미디어 CONT이 2X 작업 용액의 동량을 첨가하여 1X로 희석세포를 aining. 치료 세포 배양 조건에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 셀 고정 : 잘 PBS로 한번 각을 씻고 처리 조건에 따라 위의 단계 2.2에서 제조 된 3.7 % PFA 주식의 1 ML을 추가합니다. 처리 조건에서 15 분 동안 배양한다. 저산소증 처리 샘플은이 지점에서 저산소증 챔버로부터 제거 될 수있다. 정착액을 제거하고 PBS 잘 한 번씩 세척 (책임 낭비 PFA 처분주의). 실온에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> Permeabilization : 세척 용액을 제거하고 각 웰에 PBS에 1 % 트리톤 X-100 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 배양한다. permeabilization 버퍼를 제거하고 PBS 잘 한 번씩 씻는다. </li><li> 레이블 RNA 검출 : <ol><li> dH보다 2 O.에서 10X 솔루션 (단계 2.3에서 준비) 1:10 희석하여 RNA 이미징 키트 반응 버퍼 첨가제의 신선한 1X 작업 솔루션을 준비합니다 </li><li> RNA 이미징 키트를 준비바로 준비 후 사용 표 2에 따라 반응 칵테일. </li><li> 세척 용액을 제거하고 각 샘플에 RNA 이미징 키트 반응 칵테일 500 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 배양한다 빛으로부터 보호한다. </li><li> RNA 이미징 키트 반응 칵테일을 제거하고 RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼 (구성 요소 F) 1 ㎖로 한 번 세척 한 후 RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼를 제거합니다. </li></ol></li><li> 선택 다중 반응 : 제조업체의 권장 사항에 따라이 시점에서 샘플을 추가로 항체 라벨을 수행합니다. </li><li> DNA 염색 : PBS로 세척 샘플 후 세척 용액을 제거. PBS의 훽스트 33342 (구성 요소 G) 1:1,000 희석. 각 웰에 희석 훽스트 33342의 1 mL를 넣고 실온에서 15 분 동안 품어, 빛으로부터 보호합니다. 훽스트 33342 솔루션을 제거하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세척 solutio를 제거n 및 광학 현미경으로 진행합니다. </li></ol> 3. 광학 현미경 <ol><li> 마운트 Coverslips는 : <ol><li> 표준 현미경 슬라이드의 중앙에 장착 매체의 10 μl를 놓습니다. </li><li> 설치 매체의 분취 량을 충당하기 위해 아래 현미경 슬라이드의 중심에 셀 측에 커버 슬립을 놓습니다. 이것은 이후의 화상 획득을 모호하게되므로 장착 매체에 거품의 발생을 피하기 위해 조심. </li><li> 그 주변에 분명 손톱 광택을 적용하여 현미경 슬라이드에 coverslip에 스틱. 실온에서 5 분 동안 건조 할 수 있습니다. 빛으로부터 보호합니다. 샘플은 다음과 같은 설치 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 이미지 수집 : 형광 검출 가능한 광 시야 현미경을 사용하여 이미지를 획득. DNA에 결합 알렉사 형석 염료 및 훽스트 33342에 대한 대략적인 형광 / 여진 발광 최대를 표 3에 나타낸다. </li><li> Perfor냉각 CCD 카메라로 40X/1.30 NA 기름 침지 렌즈와 이미지를 캡처를 사용하여 M 이미징. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 화상 처리 소프트웨어 (재질 표 참조) 전에 OMERO 클라이언트에 오기까지를 사용 Deconvolve 이미지. 모든 다른 조건으로 제어 정상 산소 세포로부터 렌더링 설정을 적용하여 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어에서 동일한 실험에서 모든 이미지의 설정을 렌더링 정상화. </li><li> 각 이미지에서 핵을 선택 현미경 이미지의 시각화 및 분석 소프트웨어의 관심 영역 (ROI) 도구 (재료 표 참조)를 사용합니다. 각 ROI에 대한 평균 농도를 구하여 30-50 세포 사이 번호 등, 강도 분석 옵션을 선택하여 각 조건에 대해 평균 및 표준 편차를 산출한다. </li><li> 4.2 단계 t에서 얻은 모든 개인의 평균 강도 값을 플로팅하여 데이터 그래프 소프트웨어 (재료 표 참조)을 사용하여 분산 형 플롯을 구축O 각 조건에서 세포 사이의 다양성을 반영합니다. 또는 평균 평균 강도 플러스 초기 RNA의 표준 편차를 나타내는 막대 그래프를 구성합니다. </li></ol>

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JRS는 글렌 코 소프트웨어, 주식, OMERO에 기여하는 오픈 소스 미국에 기반을 둔 광고 회사의 설립자입니다.

우리는 골육종 (U2OS) 세포의 RNA 합성에 저산소증의 영향을 검토하는 RNA 이미징 장비의 우리의 사용을 설명했다. 이 기술은 비교적 간단하고 단일 세포 수준에서 해외 전사에 대한 데이터를 제공한다. 우리는 저산소 챔버에서 라벨을 통합하는이 키트에 대한 기존의 프로토콜을 수정했습니다. 우리의 지식이 저산소증의 RNA 합성의 변화를 측정 할 수있는이 기술의 사용의 첫 번째 보고서입니다. 이 방사성 동위 원소를 필요로하지 않고 통제 된 분위기의 워크 스테이션에서 작업의 한계를 기술적으로 호환이기 때문에 우리가 사용하는 RNA 이미징 키트는 저산소증의 실험에 적합하다. 이 기술에 관심 효율적으로 고정하고 샘플의 라벨 일반적인 문제. 그것은 PFA는 샘플이 신선하고 샘플의 낮은 배경 염색을 보장하기 위해 설명 된대로 &#39;클릭&#39;반응에 따라 세척 단계를 수행하는 고정하는 것이 매우 중요합니다. B의 경우ackground 형광이 단계 2.7.4 후 1 ㎖의 RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼로 한번 더 세척하는 것이 좋습니다 문제가된다. 여기에 언급 된 RNA 이미징 키트는 사용과 반응의 특이성과 속도의 용이성 측면에서 RNA 이미징 기술에 상당한 진보를 나타냅니다. 이 기술은 주로이 샘플 레이블을하는 데 걸리는 시간에 의해 제한됩니다. RNA 이미징 키트는 일반적으로이 기간 내에 발생할 수있는 글로벌 RNA의 급격한 변화의 시험을 방지하는 1 시간의 표시 기간이 필요합니다. 이러한 이유로 우리의 처음 지점을 1 시간 15 분으로 제한됩니다 때문이다. 이 기술은 주로 예를 들어,이 RNA 이미징 키트 phalloidin도 염색와 호환되지 않습니다, 다른 형광 마커와의 호환성을 시약에 관해서 몇 가지 다른 제한과 관련이 있습니다. 세포의 RNA 합성을 공부하는 모든 기존의 접근 방법으로 변형 된 뉴 클레오 시드의 결합을 기반으로초기 RNA와 다른 방법으로 통합 라벨의 검출. 선구적인 접근 방식은 오토 라디오와 검색 다음에 방사성 표지 된 RNA 전구체를 사용하여 기반으로했다. 이 방법은 세포주기의 단계 및 다른 중요한 발견 발견되었다; 그러나, 이러한 방사능 작업, 긴 노출 시간과 오토 라디오 6의 낮은 해상도의 이미지의 성가신 성격 등 많은 단점이있다. 필드 다음 사전 방사능의 필요성을 제거하기 위해 면역 화학 수단 악용. RNA는 면역 화학 감지 다음 BRU의 결합에 의해 표시되었다. 그러나, 효율적인 항체는 DNA 또는 세포 형태의 손실을 야기하고 형광 표지 된 항체 (13)와 자신의 추가 검출을 방지, 많은 단백질의 에피토프를 손상 RNA에 접근을 개선하기 위해 핵산 변성 요구 바인딩. &#39;클릭 화학의 기술의 도입은 검출 단계와 t을 단순화그 절차 오토 라디오 및 면역 화학에 비해. 이 기술은 5 ethyniluridine 단자 알킨은 구리 (I)의 존재 형광가 결합 아 지드와 결합 지드 - 알킨 Huisgen의 고리 화 반응을 기반으로합니다. 반응은 신속하고 특정 추가 단계를 필요로하지 않으며, 다른 세포 성분의 면역 검출와 쉽게 호환됩니다. 이 RNA 이미징 기술을 사용하여, 우리는 세포가 동일한 단층 인구에서 저산소증에 반응하여 상이한 RNA 합성 수준을 가지고 있음을 보여 주었다. 우리는 RNA 생산 만의 효과를 조사하기 위해 실험을 제한; 그러나, RNA 생산의 더 복잡한 분석을 허용 변경됨 추가적인 다중 반응을 수행하기 위해이 RNA 촬상 키트 전적으로 가능하다. 예를 들어, 인산화 된 RNA 중합 효소 II 또는 그 번역의도 구성 요소 수준의 활성 전사의 마커에 대한 특정 항체를 사용하여 보조 염색단백질로 변환되고, 새로 생성 된 RNA의 양의 표시를 제공하기 위해 기 기계들이 가능하다. 같은 굴지, 저산소증으로 크게 변경하지 않아야 단백질 등의 추가 단백질은 추가 컨트롤로 테스트 할 수 있습니다. 그것은 서로 다른 세포가 다른 RNA 합성 속도와 저산소증도 다른 반응이있을 것이다 가능성이 매우 높다 더욱이, 다른 세포 유형, 테스트 할 수 있습니다. 이 RNA 촬상 키트의 사용은 설명 된 단계들이 수행된다 제공 상당히 간단하다. 프로토콜의 중요한 단계는 세포 도금, 세포 고정과 염색 및 이미지 수집을 포함한다. 그것은 현저 결과에 영향을 미칠 것이다 실험에서 위로 또는 아래 합류 방지하는 바와 밀도로 세포를 플레이트에 중요하다. 그것은 촬영 셀의 가장 &#39;스냅 샷&#39;을 보장, 신선한 정착액을 사용하고 혈중 알코올 농도를 줄이기 위해 염색 한 후 세포를 세척 할 때 조심하는 것이 중요하다효율적인 분석을 위해 허용되는 수준으로 kground. 마지막으로, 이미지 수집의 방법은 이후의 분석을 위해 충분히 좋은 품질의 이미지를 달성하기 위해 매우 중요합니다. 우리는 광학 등 전 세계적으로 가장 연구 집약적 센터에서 사용할 수 있습니다이 프로토콜에 사용되는 현미경으로 샘플을 검사하는 데 사용할 수있는 최고의 광학 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.

저산소증 (낮은 산소 긴장은) 조직에 정상적인 산소 공급이 방해 될 때 발생합니다. 환경 산소는 많은 세포 유형에 대한 중요한 단서를 제공하고, 영양 및 신호 분자 모두입니다. 환경 산소의 변화는 저산소증 유도 성 요인 (HIFs)로 알려진 필수적인 전사 인자 가족의 활동을 제어 dioxygenases의 그룹에 의해 감지된다. HIFs는 두 개의 서브 유닛, α와 β로 구성된다. 세 알려진 HIF-α의 이소 형 (1, 2, 3)과 HIF-1β의 여러 스플 라이스 변종이 있습니다. HIF-1β는 구성 적 표현과 환경 산소 수준 1에 의해 규제되지 않습니다. HIF-α의 가족 구성원은 동적 프 롤릴-hydroxylases (박사 학위)의 클래스에 의해 규제 요인은 HIF (FIH)를 억제하는; HIF-α 2,3의 수산화을 촉진하기 위해 공동 요인으로 산소를 필요로 둘. 정상 산소 상태에서 HIF-α 가족은 수산화하고 proteosom에 대한 태그E3-리가, 폰 Hippel 린다 우 (VHL) 앨라배마 저하. 저산소증에서 박사 학위 및 FIH는 비활성 또는 감소 활동을해야합니다. HIF-α 아형 안정화 될 HIF-1β와 헤테로 다이머를 형성하고, 저산소 환경 (도 1a)에 대한 세포 반응을 제공하는 유전자의 전사에 영향 4. RNA 분석을위한 현재 기술은 특정 세포 집단에서 평균 값의 정량화에 초점을 맞 춥니 다. 세포는 그들의 적대적 환경 5에 적응할 수 있도록 유전자의 무수한의 전사를 개시함으로써 저산소 자극에 반응한다. 그러나, 저산소증 자주 그라데이션으로 존재하고, 저산소 환경에서 세포가 균일 한 저산소 자극을받지 않는다. 우리는 저산소증에있는 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 합성을 검토하는 산소 제어 워크 스테이션에서 Click-IT RNA 이미징 키트의 구현을 설명합니다. RNA 이미징 키트를 사용하여lkyne 수정 된 뉴 클레오 시드, 5 -에 티닐 우리 딘 (EU)과 세포와 조직 6 시간적 공간적으로 글로벌 RNA 합성의 검출을 가능하게 chemoselective 내고. 간략하게, 세포는 저산소증 및 EU의 존재 하에서 배양으로 처리된다. 그런 다음 고정 per​​meabilized 및 초기 RNA에 유럽 연합 (EU)의 결합은 아 지드 포함하는 염료와 EU의 chemoselective 결찰에 의해 감지된다. 이 반응의 일반적인 워크 플로는 그림 1B에 표시됩니다. 우리는 저산소증 치료의 결과 단일 세포 수준에서 RNA 합성을 검사하는 RNA 이미징 키트를 사용했습니다. 알킨 태그의 작은 크기는 특히 RNA로 수정 된 뉴 클레오 시드의 효율적인 결합을 가능하게합니다. chemoselective 결찰 또는 &#39;클릭&#39;반응은 매우 효율적이고 빠르고 7-10 다릅니다. 반응의 모든 구성 요소는 생체 불활성이고, 반응은 더 극단적 인 온도 나 용매를 필요로하지 않는다. 클릭 반응은 부정기존의 radiolabelling에 대한 요구 사항과 출력 이후의 결과를 직접 시각화 할 수는 빛이다. 또, 검출 분자는 쉽게 RNA-단백질 상호 작용을 검출하기위한 항체를 포함한 멀티 플렉스 분석을 허용 복잡한 샘플을 관통 할 수있다. 이 RNA 영상 분석 알렉사 플 루어 및 형광 (FITC) 등의 유기 염료와 호환됩니다. 우리는 원격 객체에 대한 오픈 현미경 환경 (OMERO)의 구현을 사용하여 우리의 세포 치료 다음 RNA 합성의 변화를 측정 하였다. OMERO은에서 사용할 수있는 오픈 소스 소프트웨어입니다 <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어에 대한 액세스, 및 다차원, 이종 데이터 세트의 관리를 포함하는 생체 데이터의 광범위한 사용을 가능하게한다. 클라이언트 애플리케이션은 원격 시각화 복잡한 생물학적 화상 데이터 (11)의 분석을 허용한다;우리는 글로벌 및 단일 세포 RN​​A의 합성에 시각적 인 변화를 계량화하는 데 사용됩니다. 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용하여 이러한 데이터하고 RNA 이미징 실험을 분석하기 위해 필요한 단계를 이하에 나타낸다. 우리는 최대 24 시간 동안 저산소증 인간 골육종의 치료 (U2OS) 세포 다음 글로벌 RNA 합성의 변화를 바라 보았다. 모든 상황에서, 우리는 RNA 생산의 수준에있는 세포에 세포 변화를 감지했습니다. 저산소증 노출의 짧은 시간에 초기 세포 RN​​A의 수준에 큰 변화가 발생하지 않았다. 그러나, 저산소증에 24 시간 노출은 세포에서 생성 된 RNA의 양을 크게 증가 결과. 저산소증에 대한 세포 반응의 대부분은 같은 4-24 시간으로 노출의 장기간, 다음 측정된다. 그러나 일부 메커니즘은, 예를 들어, 훨씬 이전에 장소에 배치됩니다; NF-κB의 활성화는 저산소증 노출 12 ~ 15 분 이내에 발생합니다. 짧은 저자 조사쌰 노출 시간 따라서 보증하고, 이러한 세포주기 및 세포 사멸과 같은 더 복잡한 반응을 손상 할 수 있습니다.

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	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">U-2 OS Primary Cells</td>
			<td style="width:92px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td align="right" style="width:115px;">92022711</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:703px;"><a href="http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&amp;dosearch=true">http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&#38;dosearch=true</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">14190094</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">41966029</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029">https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10270106</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-603E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin-EDTA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hypoxia Chamber</td>
			<td>Ruskinn</td>
			<td>InVivo2 300</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ruskinn.com/products/invivo2300">http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-10329/C10330</td>
			<td></td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&#38;catKey=601107&#38;filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&#38;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76240</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10M NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37% HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20252.335</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&amp;searchOp=or">https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&#38;searchOp=or</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VectaShield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483">http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actinomycin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deltavision Core Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.appliedprecision.com/">http://www.appliedprecision.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">softWoRx [Refered to in text as image processing software]</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.api.com/softworx.asp">http://www.api.com/softworx.asp</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CoolSnap HQ2 CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php">http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software]</td>
			<td>OME</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software]</td>
			<td>Systat Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php">http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of global rna synthesis at the single cell level following hypoxia

산소 가용성의 저산소증 또는 저하는 많은 생리적, 병리 적 과정에 참여하고있다. 분자 수준에서, 세포는 적절한 조율 세포 반응을 마운트하기 위해 특정 전사 프로그램을 개시. 셀은 그들의 활동을위한 보조 인자로서 분자 산소를 요구하는 여러 산소 센서 효소를 소유한다. 이들은 프 롤릴-hydroxylases에서 히스톤 demethylases에 이르기까지 다양합니다. 저산소증에 세포 반응 분석 연구의 대부분은 세포 집단과 보통의 연구에 기초하고 있으며, 저산소 세포의 이러한 단일 세포 분석으로 거의 수행되지 않는다. 여기에서 우리는 현미경 분석 및 정량화 다음에 산소 제어 워크 스테이션에서 클릭 - IT RNA 이미징 키트를 사용하여 저산소증에있는 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 합성을 분석하는 방법을 설명합니다. 시간의 길이가 다른 대 저산소증에 노출 된 암 세포를 이용하여, RNA는 각 셀에 표시되고 측정된다. 이 분석은 허용저산소 스트레스 다음 글로벌 RNA의 합성에 시간과 세포에 세포 변화의 시각화.

RNA 이미징 키트 반응의 회로도는 그림 1B에 표시됩니다. 우리는 정량적으로 개인 (단일 셀) 및 글로벌 수준 (세포의 인구) 모두에서 저산소증 치료 다음 U2OS 세포에서 총 RNA의 합성을 결정하는 반응을 이용했다. 세포는 저산소증 및 EU의 존재 하에서 배양을 시행 하였다. 그런 다음 고정 per​​meabilized과 유럽 연합 (EU)의 결합은 아 지드 포함하는 염료와 EU의 chemoselective 결찰에 의해 발견되었습니다했다. 이것은 검출 된 형광 광 현미경을 사용하여 정량화 될 수있는 형광 방출의 반응 결과를 &#39;클릭&#39;.도 2a는 본 실험에서의 전형적인 결과를 나타낸다. 형광 표지 된 세포는 빨간 모조 착색하고 이미지가 원격 객체에 대한 오픈 현미경 환경 (OMERO)에 개설되었습니다. 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어가 내장되어 개별 하위 세포 구 조를 선택하는데 사용될 수있다 ROI 도구정량적 뚜 및 선택 영역 내에서 이미지의 강도를 분석 할 수 있습니다. 클라이언트 프로그램이 도구의 사용에 다음 데이터 출력의 전형적인 예는도 2b에서 볼 수있다; 개별 셀의 강도는 데이터의 유효 기간을 확인하기 위해 육안 검사 역할을하는 실험의 대표 이미지와 함께 표시됩니다. 개별 셀 형광 농도는 처리 된 세포 집단 내의 개별 셀룰러 농도의 분포를 보여주는 캐터 차트로 나타내 어질 수있다. 그래프의 종류의 예는도 2c에서 볼 수있다. 이 처리 결과의 신속한 비교를 허용하고 명백하게 다르게 기본 데이터 표현을 사용 가려 처리 세포 집단 내의 상당한 이질성을 설명하기 때문에이 방법으로 강도 데이터를 플로팅하는 것이 유용하다. 응답 이질성이 실험에 흥미 균일 한 저산소 자극이 있었지만 때문에셀 pplied, 동일 단층 모집단에서 모든 세포가 자극에 다르게 반응하는 것이 분명하다. 그림 2D는 우리의 실험에서 전체 결과를 보여줍니다. 처리 인구 내의 모든 세포에서 형광 강도는 평균 다음이 막대 차트에 그려진했다. 학생의 t-시험은 제어 크게 상이한 각 처리 군의 통계적 확률을 계산하는 데 사용되었다. 흥미롭게도, 이러한 데이터는 항상 1보다 큰 시간 30 분 (U2OS 세포를 저산소 상태로 처리되어 시간에 따른 해외 RNA 합성에 통계적으로 유의 한 증가가 있음을 보여준다 * p &lt;0.01]. ** p &lt;0.05 *** P &lt;0.001 N&gt; 30). 이러한 데이터는 저산소증 치료의 긴 기간 다음, 세포도이 적대하는 저산소 환경에서 RNA의 생산에 노력을 집중한다 것을 보여줍니다. 악 티노 마이신 D의 처리는 완전히 예상대로 형광 강도를 절제한다.<img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> 그림 1. A. HIF 시스템은 세포의 산소의 변화에 응답합니다. 이 개략적 저산소증에 프 롤릴 수산화 효소 (박사 학위)과 폰 Hippel-Lindau에서 단백질 (VHL)에 의해 그 이후 polyubquitination에 의해 HIF-α 수산화 (-OH)를 방지하여 HIF의 이종는 안정. . B.의 RNA 합성은 클릭 - IT 분석을 이용하여 검출 할 수있다 세포 저산소증에 대한 세포 반응을하는 데 도움이 수많은 유전자의 활성화에 HIF 안정화 결과; 세포가 클릭 반응이 형광 강도와 광학 현미경에 의해 정량화 될 수있다 RNA 합성을 감지 치료 후 EU로 표시되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">큰 적이있는를 보려면 여기를 클릭하세요</a>이 그림의 이온. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> 그림 2. OMERO에서 A. 스크린 샷 RNA 라벨링 다음과 같은 일반적인 미세한 출력을 표시합니다. 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어는 신속 내장형 ROI 매크로를 사용하여 개별 셀 레벨에서 강도 데이터를 추출 할 수있다. 이 명령의 출력의 스크린 샷이 B. 글로벌 RNA의 합성에 도시하는 것은 개별 셀의 강도에서 유추 할 수있다,의 범위는 * P C.이 집계 데이터의 형식적인 표현이 D. 볼 수 있습니다 산점도에서 볼 수 있습니다 &lt;0.01; * P &lt;0.05 *** p &lt;0.001 N&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <tabl전자 국경 = &quot;0&quot;cellpadding이 = &quot;0&quot;cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> 세포 배양 시약 </td></tr><tr><td> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 pH 7.2-7.6 </td></tr><tr><td> 둘 베코의 수정 이글스 중간 (DMEM) </td></tr><tr><td> 태아 혈청 (FCS) 필터 소독 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td></tr><tr><td> 0.05 % 트립신-EDTA (1 %) </td></tr><tr><td> 70 % 에탄올 </td></tr><tr><td> 악 티노 마이신 D (1 ㎍ / ㎕의 주식) </td></tr><tr><td> 세포 배양 장비 </td></tr><tr><td> 멸균 파스퇴르 피펫 </td></tr><tr><td> 문화에 세포의 유지 관리 및 치료에 적합한 세포 배양 처리 된 플라스틱 제품의 범위 </td></tr><tr><td> 물 목욕은 37 ° C로 설정 </td></tr><tr><td> 층류 공기 유동 후드 </td></tr><tr><td> 창업 보육 센터는 37 ° C에서 5 % CO 2를 설정 </td></tr><tr><td> 저산소증 워크 스테이션은 37 ° C에서 5 % CO 2, 1 % O 2를 설정 </td></tr><tr><td> 유리 커버 슬립 </td></tr><tr><td> 정밀 핀셋 </td></tr><tr><td> 혈구 </td></tr></tbody></table> 표 1. U2OS 세포의 배양에 필요한 시약 및 기기. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> 반응의 구성 요소 </td><td colspan="6"> Coverslips는 수 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 클릭-IT RNA 반응 버퍼 (구성 요소 C) </td><td> 428 μL </td><td> 856 μL </td><td> 1.7 ML </td><td> 2.1 ML </td><td> 2.58 ML </td><td> 4.3 ML </td></tr><tr><td> CuSO 4 (구성 요소 D) </td><td> 20 μL </td><td> 40 μL </td><td> 80 μL </td><td> 100 μL </td><td> 120 μL </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 아 지드 (단계 2.3에서 준비) </td><td> 1.8 ㎕의 </td><td> 3.7 ㎕의 </td><td> 7.4 ㎕의 </td><td> 9.3 ㎕의 </td><td> 11.28 μL </td><td> 18.8 μL </td></tr><tr><td> 클릭-IT 반응 버퍼 첨가제 (단계 2.3에서 준비) </td><td> 50 μL </td><td> 100 μL </td><td> 200 μL </td><td> 250 μL </td><td> 300 μL </td><td> 500 μL </td></tr><tr><td> 대략적인 총 양 </td><td> 500 μL </td><td> 1 ㎖ </td><td> 2 ㎖ </td><td> 2.5 ML </td><td> 1.5 ML </td><td> 5 ㎖ </td></tr></tbody></table> . 표 2 RNA 촬상 키트 반응 칵테일 : 염색되는 커버 슬립의 개수에 따라 RNA 촬상 키트 반응을위한 마스터 믹스 성분의 비율을 자세히 참조 테이블. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 형광 </td><td> 여기 (NM) </td><td> 방출 (NM) </td></tr><tr><td> 알렉사 플 루어 488 </td><td> 495 </td><td> (519) </td></tr><tr><td> DNA에 결합 훽스트 33342, </td><td> (350) </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . 표 3 형광 / 여기 발광 최대 : DNA에 결합 알렉사 플 루어 염료 및 훽스트 33342에 대한 대략적인 형광 / 여기 방출 최대.

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Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

우리는 촬상을 사용 저산소증 글로벌 RNA 합성의 분석을위한 기술을 설명한다. RNA의 클​​릭 - 화학 라벨은 이전에 저산소증에서 수행하고 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 변화의 시각화를 허용하지 않았습니다. 이 접근법은 해외 RNA 합성 세포 간 변화의 직접적인 시각화를 허용하며, 기존의 평균화 RNA 기술을 보완한다.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

analysis-global-rna-synthesis-at-single-cell-level-following

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K 조회수.  University of Dundee, UK.  우리는 촬상을 사용 저산소증 글로벌 RNA 합성의 분석을위한 기술을 설명한다. RNA의 클​​릭 - 화학 라벨은 이전에 저산소증에서 수행하고 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 변화의 시각화를 허용하지 않았습니다. 이 접근법은 해외 RNA 합성 세포 간 변화의 직접적인 시각화를 허용하며, 기존의 평균화 RNA 기술을 보완한다. 

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

연구

생물학

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

대기압에서 질량 분석법에 의해 단일 ​​세포의 직접 분석

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...